第一部分题目：IL-33在SAH后的表达、定位及可能作用研究背景：蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)特别是动脉瘤性蛛网膜下腔出血是一种高发病,高致死、致残的中枢神经系统疾病；是临床三大脑血管疾病之一,约占到所有脑卒中的5%；国外统计发现大约有12%的SAH患者在就医前就已经死亡,另外在SAH患者中大约有30%的病人在发病后2天内死亡,大约40%的病人在发病后1个月内死亡；即使患者能存活下来,也有大约20%的患者会出现终生的神经功能障碍,超过1/3的患者生活不能自理。并且在动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者中,第一次破裂出血后如得不到有效的治疗,2周内再出血概率为12%,再出血死亡率可高达到72%。现研究认为SAH后3d内发生的早期脑损伤(early brain injury, EBI)对SAH患者的预后有着重要的影响；SAH早期脑损伤的机制包括：<1>颅内压的升高、脑组织血流灌注量的减少；<2>急性脑血管痉挛；<3>血脑屏障(BBB)的破坏；<4>炎症及凋亡反应；<5>血红蛋白及其代谢产物的毒性：<6>脑水肿等；这些都是近年来研究的热点。白介素33(Interleukin-33, IL-33)是白介素1(Interleukin-1, IL-1)家族的新成员,它的分子量为30kDa：因其具有IL-1家族所固有的结构域,因此IL-33被归类为IL-1家族。白介素1(IL-1)家族是一类前炎症细胞因子与中枢神经系统关系密切。不同的白介素1家族成员在中枢神经系统中作用不同,有时甚至表现出相反的作用。而IL-33作为IL-1家族的新成员,它与中枢神经系统也可能存在相关性,但是这种相关性现在还明确。IL-33在中枢神经系统中呈高分布状态,目前有研究认为被激活的具有完整生物学功能的IL-33是细胞对胞外危险环境的反应信号；IL-33在未激活前是以前体形式存在的,在受到刺激后需经过剪切修饰后才进行释放,但是IL-33的激活与修饰释放过程现在还是不清楚的；现在认为IL-33的剪切修饰很可能与半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase:caspase)家族有关。可溶性ST2(sST2).ST2V和跨膜受体ST2(ST2L)是lL-33的主要受体,其中sST2被认为是IL-33的诱骗受体,可与ST2L竞争性结合IL-33,起拮抗剂作用。ST2L是IL-33主要的功能受体,主要由Th2细胞、干细胞和NKT细胞分泌；在反应中IL-33与ST2结合后再与IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAcp)结合形成三聚体受体复合物,其中ST2与配体IL-33结合,IL-1RAcp将信号转导、传入细胞内,激活相关信使与蛋白,最终引起髓样初级反应蛋白88(MyD88)、白细胞介素-1受体相关激酶-1/4(IRAK-1/4)的聚集,激活下游的核因子-κB(NF-κB)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的信号通路,MAPK通路可以激活下游的信号调节激酶(ERK),p38等因子；NF-κB通路可激活相关的炎症反应因子如白介素-1β(IL-Iβ)、肿瘤坏死因子.-α(TNF-α)。现研究认为IL-33是一多功能的因子,参与多种病理反应过程,在不同的系统中可以起到不同的作用：如在心血管系统中起心肌保护作用；在消化系统中起减轻炎症作用；而在呼吸系统炎症中却起到加重炎症反应的作用；但大多数研究均认为IL-33可参与相关炎症反应的病理过程,而炎症反应在SAH后病理反应中起着重要作用,并且IL-33在中枢神经系统中高表达,因此我们推测IL-33有可能参与SAH后的炎症反应过程。目的：本实验主要目的为检测IL-33的在SAH后的表达和定位情况,并探讨IL-33在SAH后可能作用。方法：1.实验动物及分组：使用成年雄性Sprague-Dawly大鼠,大小约为280-320g按随机方法分为空白对照组和SAH组,其中SAH组又分为SAH模型建立后2h、6h、12h、1d、2d、3d、5d7组。2.SAH模型制作和组织的获取：采用视交叉前池注血模型,在相对应的时间点处死大鼠,选取视交叉前池有积血点的大鼠取颞叶皮质为标本。3. Western blot analysis:利用凝胶电泳分离总蛋白,以检测空白对照组和蛛网膜下腔出血组各时间点组IL-33、MyD88总蛋白的表达情况。利用凝胶电泳分离核蛋白,以检测在空白对照组和蛛网膜下腔出血组各时间点组NF-κB亚单位P65核蛋白的表达情况。4. RT-PCR analysis:利用RNA提取试剂盒提取大鼠颞叶皮层脑组织的RNA,并进行定量分析；在使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA,利用试剂盒并进行实时定量PCR反应,以检测在空白对照组和蛛网膜下腔出血组各时间点大鼠颞叶皮层中IL-33和IL-1β mRNA表达情况。5.免疫组化染色：制作组织切片,利用免疫组化染色方法检测在空白对照组和蛛网膜下腔出血后1天在大鼠颞叶皮层中IL-33表达量的变化,及IL-33在细胞内定位的情况。6.免疫荧光双染：制备组织冰冻切片,利用免疫荧光双染方法检测空白对照组和蛛网膜下腔出血后1天IL-33在神经元细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞中的表达和分布情况7.统计学方法：采用统计软件SPSS13.0对数据进行分析,所有定量数据均以均数±标准误(x±SEM)表示。多组均数比较先采用单因素方差分析,接着采用Dunnett-t检验,均以p<0.05为有统计学意义。行相关性分析时使用Linear regression分析方法进行统计分析,以p<0.05为有统计学意义。结果：1.动物实验数量分析：实验过程中空白组模型制作成功率100%,SAH组模型制作成功率75%；另外SAH组大鼠死亡率、视交叉前池无积血点比率分别为19.7%和6.8%。2.SAH引起大鼠大脑皮质中IL-33蛋白水平升高：IL-33蛋白水平在正常大鼠大脑颞叶皮质中呈低表达状态,SAH引起大鼠大脑皮质中IL-33蛋白水平升高,在24小时出现峰点。与空白对照组相比,SAH后6h、12h、1d、2d、3d IL-33的蛋白水平有显著升高(p<0.05),具有统计学意义。3.SAH引起大鼠大脑皮质中IL-33 mRNA、IL-1β mRNA水平升高,并且两者mRNA的改变趋势具有正相关：与对照组相比较,SAH后6h、12小时、1天、2天、3天的IL-33 mRNA水平显著升高(p<0.05),在24小时出现峰点.；而IL-1β mRNA水平在SAH后1天、3天、5天有显著性升高(p<0.05),也在24小时出现峰点。行统计分析发现两者变化趋势存在正相关,r=0.50,p<0.05。4.免疫组化示SAH后IL-33表达增多,IL-33定位于细胞核与细胞浆中：与空白对照组相比较在SAH后1天IL-33表达量增多(p<0.05),IL-33细胞阳性率分别为34.8%和67.9%；并且SAH后IL-33在细胞浆及细胞核中均有表达。5.IL-33在神经元及星形胶质细胞中有表达,在小胶质细胞中不表达：大鼠大脑皮质中,在对照组和SAH后1天组中神经元及星形胶质细胞均有IL-33的表达,并且SAH引起IL-33表达量的升高(p<0.05)。神经元中SAH组与对照组IL-33细胞阳性率分别为68.9%、46.4%；星形胶质细胞中比率分别为：26.7%、14.1%。小胶质细胞中无IL-33的表达。6.SAH引起大鼠大脑皮质中总蛋白MyD88和核蛋白NF-κB p65蛋白水平升高,并且两者蛋白含量变化趋势与IL-33蛋白表达量的变化趋势均具有正相关：SAH引起大鼠大脑皮质中总蛋白MyD88和核蛋白NF-κB p65蛋白水平升高；与空白对照组相比,MyD88总蛋白在SAH后12h、1d、2d、3d、5d有显著升高(p<0.05); NF-κB p65核蛋白在SAH后12h、1d、2d、3d、5d有显著升高(p<0.05)；两者均在1天出现峰点。行相关性分析发现SAH后IL-33蛋白变化趋势与MyD88总蛋白变化趋势存在正相关,r=0.57,p<0.05;SAH后IL-33蛋白变化趋势与NF-κBp65核蛋白变化趋势存在正相关r=0.61,p<0.05。结论：1、SAH引起IL-33表达的升高；2、IL-33定位在神经元和星形胶质细胞的细胞核与细胞浆中；3、SAH后IL-33与IL-1β mRNA有正相关,IL-33与MyD88、NF-κBp65蛋白变化有正相关。4、IL-33有可能通过IL-33→MyD88→NF-κB p65通路参与SAH后的炎症反应过程。第二部分题目：外源性IL-33在SAH后作用和可能作用机制研究背景：在第一部分试验中,我们初步检测了IL-33在蛛网膜下腔出血后的表达及定位情况：我们实验室前期研究发现MyD88→NF-κB途径可参与SAH后的炎症反应,实验中我们还发现SAH后IL-33分别与MyD88、NF-κB p65、 IL-1β变化有正相关；因此我们探讨了IL-33通过IL-33→MyD88→NF-κB途径参与SAH后的炎症反应的可能性；现为进一步验证这种可能性,我们在SAH后予外源性IL-33,并检测下游MyD88、NF-κB的变化情况,及脑水肿和神经功能评分的变化。目的：本实验为检测IL-33通过IL-33→MyD88→NF-κB途径参与蛛网膜下腔出血后的炎症反应的可能性,及IL-33对大鼠蛛网膜下腔出血预后的影响。方法：1.分组实及给药：使用成年雄性Sprague-Dawly大鼠,大小约为280-320g；按随机方法分为蛛网膜下腔出血组(SAH)、蛛网膜下腔出血+生理盐水组(SAH+Vehicle)、蛛网膜下腔出血+低剂量外源性IL-33组(SAH+LOW IL-33)、蛛网膜下腔出血+高剂量外源性IL-33组(SAH+HIGH IL-33)。SAH+Vehicle组在SAH模型制作后半小时往视交叉前池注射无菌生理盐水10ul; SAH+LOW IL-33组在SAH模型制作后半小时往视交叉前池注射外源性IL-33 30ng(溶于10ul生理盐水中)；SAH+HIGH IL-33组在SAH模型制作后半小时往视交叉前池注射外源性IL-33 300ng(溶于10ul生理盐水中)；SAH组模型制作后不再往视交叉前池注射任何液体。2.SAH模型制作和组织的获取：采用视交叉前池注血模型,在模型制作后1天选取视交叉前池有积血点的大鼠取颞叶脑皮质为标本。3. Western blot analysis:用于检测各组在蛛网膜下腔出血后1天MyD88总蛋白和NF-κB p65核蛋白的改变情况。4. RT-PCR analysis:用于检测各组在蛛网膜下腔出血后1天MyD88和IL-1βmRNA的改变情况。5.神经功能评分：在各组造模后24小时,进行神经功能评分,本实验使用Garcia评分系统,该评分最高评18分,最低3分；用于评估各组大鼠SAH的严重程度。6.脑水肿测定：在蛛网膜下腔出血模型制作后1天处死大鼠,测定脑水肿,计算方法为([湿重-干重]/湿重]×100%)；用于评估大鼠脑水肿严重程度。7.统计学分析：采用统计软件SPSS13.0对数据进行分析,所有定量数据均以均数±标准误(x±SEM)表示,多组均数比较先采用单因素方差分析,接采用Dunnett-t检验,均以p<0.05为有统计学意义。结果1.动物实验数量分析：本实验原计划在使用48只大鼠,实际使用61只大鼠,在SAH组有3只大鼠死亡或者造模失败,模型制作成功率为80%；在SAH+Vehicle组有4只大鼠死亡或者造模失败,模型制作成功率为75%；在SAH+LOWIL-33组有4只大鼠死亡或者造模失败,模型制作成功率为75%；在SAH+HIGHIL-33组有2只大鼠死亡或者造模失败,模型制作成功率为85%.2.SAH后外源性IL-33引起大鼠大脑皮质中MyD88总蛋白表达量的升高：与SAH组相比SAH+Vehicle组MyD88总蛋白水平的改变并无显著性差异；与SAH组相比,SAH+LOW IL-33组与SAH+HIGH IL-33组MyD88总蛋白水平有显著升高(p<0.05)。3.SAH后外源性IL-33引起大鼠大脑皮质中NF-κB p65核蛋白表达量的升高：与SAH组相比较SAH+HIGH IL-33组NF-κB核蛋白有显著性升高(p<0.05)。与SAH组相比SAH+Vehicle组与SAH+LOW IL-33组NF-κB核蛋白含量的改变并无显著性差异。4.SAH后外源性IL-33引起大鼠大脑皮质中MyD88. IL-1βmRNA水平提高：与SAH组相比SAH+LOW IL-33组和SAH+HIGH IL-33组MyD88 mRNA水平有显著性提高(p<0.05),SAH+Vehicle组无显著性差异；与SAH组相比SAH+LOW IL-33组和SAH+HIGH IL-33组IL-1β mRNA水平有显著性提高(p<n05),SAH+Vehicle组无显著性差异。5.SAH后外源性IL-33引起大鼠神经功能评分降低：与SAH组相比SAH+HIGH IL-33组神经功能评分有显著性降低(p<0.05),SAH+Vehicle组、SAH+LOW IL-33组无显著性差异。6.SAH后外源性IL-33加重大鼠脑水肿：与SAH组相比SAH+LOW IL-33组和SAH+HIGH IL-33组脑水肿显著性加重(p<0.05)。与SAH组相比SAH+Vehicle组脑水肿无显著性差异。结论：1.SAH后外源性IL-33可引起MyD88总蛋白、NF-κB p65核蛋白表达量的升高2.SAH后外源性IL-33引起大鼠大脑皮质中MyD88mRNA, IL-1βmRNA水平提高3.IL-33可通过IL-33→MyD88→NF-κB通路参与SAH后的炎症反应过程4.IL-33可能引起大鼠SAH的不良预后。