研究背景及目的胰岛素(Insulin, INS)是治疗糖尿病最有效的药物之一,对糖尿病的治疗有着极其重要的作用。但由于INS的稳定性较差,对酸、热及酶等敏感,口服或者经由其它非注射途径给药后容易被人体胃肠道内的酸以及蛋白酶降解或者破坏,上述因素均可造成INS的生物利用度较低,临床上常规仍使用INS注射剂,故糖尿病患者需接受长期频繁的注射而造成患者顺应性降低。因此,为了有效发挥INS的作用并达到良好的治疗效果,选择合适的药物载体,发展INS的缓释、控释给药系统是极有必要的。近年来,具有优良生物相容性、生物可降解性的高分子材料已应用于纳米给药系统,使之成为多肽蛋白质药物的有效载体,可以达到以下目的：①避免多肽类药物经胃肠道酶降解而提高其稳定性；②通过制备INS的缓、控释制剂来降低不良反应,延长降血糖时间,避免多次注射给药而改善患者顺应性；③发挥药效的同时,降低给药剂量,避免或减少药物毒副作用的发生；④增大载药量,载体材料经过一定的修饰后可对病变部位实施靶向给药；⑤纳米载体可通过改变膜转运机制使透过生物膜的药物增加,有利于药物在细胞内发挥作用。目前,应用于制备纳米给药系统的高分子材料主要有天然高分子聚合物和可生物降解的高分子聚合物,天然高分子聚合物主要有明胶、蛋白类、壳聚糖及其衍生物、海藻酸盐系多糖类化合物和右旋糖酐及其衍生物等等；近年来,可生物降解的高分子聚合物发展迅速,它可以通过水解或酶解作用降解,在体内释药后无残留物,常用的该类高分子聚合物主要有聚碳酸、聚氨基酸、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)等等。同时,上述高分子载体材料在多肽和蛋白类药物的纳米给药系统中也有广阔的应用。例如,Nathalie Reix等深入研究了INS-PLGA纳米粒的体内外吸收机制和体外降糖效果,证明PLGA载药纳米粒能克服肠道障碍后入血吸收且降血糖效果明显。J Sanyog等利用叶酸可介导内吞作用来增加药物吸收的原理,合成了叶酸修饰聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物(FA-PEG-PLGA),包埋INS得到载INS纳米粒,大鼠口服该载INS纳米粒后的降血糖作用可维持长达24 h,且降糖过程中无突然的血糖下降导致的低血糖休克现象出现,说明该聚合物体系在作为INS缓控释给药系统方面有潜在的应用。本实验室常用的高分子载体材料有聚乙二醇(PEG)、聚己内酯(PCL), PEG是FDA认可、国家药典收载的药用辅料,具有亲水性、生物相容性、体内无毒且免疫原性低等众多优点,常用来做表面修饰材料,改善聚合物载体的亲水性；PCL由于在生物体内可彻底降解,是广泛应用的生物降解性缓控释载体。选用PEG、ε-CL作为基础材料合成两亲性三嵌段共聚物,在此基础上对三嵌段共聚物进行了化学修饰,接枝富含阳离子的聚乙烯亚胺(PEI)得到新型五嵌段聚合物：聚乙烯亚胺-聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯-聚乙烯亚胺(PEI-PCL-PEG-PCL-PEI),旨在利用聚阳离子高分子聚合物与部分带负电荷INS之间经静电作用和亲疏水作用可形成聚电解质纳米复合体,因而达到增强药物分子与聚合物分子之间的相互作用,提高药物稳定性,延缓药物释放并降低突释阶段药物释放量的目的。该新型五嵌段聚合物中的PEI嵌段经PEG修饰后,因PEG占据了PEI的伯氨基和屏蔽其正电荷而致使PEI毒性降低；同时由于引入了疏水性嵌段PCL,新的五嵌段聚合物可作为两亲性高分子聚合物。本文以该新型五嵌段聚合物作为载体材料制备了聚合物载INS纳米粒,并运用一定方法考察了该聚合物载INS纳米粒的理化性质。此外,考虑到为获得具有治疗意义的体内降血糖效果及从提高药物的生物利用度、实际应用方便与否以及实验具体操作可行性的角度来讲,注射给药仍作为INS的主要给药方式。因此,发展可用于注射的INS纳米给药系统是极有必要的,故选择皮下注射该聚合物载INS纳米粒的方式考察其体内降血糖效果,以期为INS的制剂开发提供参考。方法1.不同分子量五嵌段聚合物PEI-PCL-PEG-PCL-PEI的合成与表征首先以PEG和ε-CL为原料,PEG作为反应的引发剂,Sn(oct)2即辛酸亚锡作为催化剂,利用开环聚合法合成了三嵌段聚合物(PCL-PEG-PCL);再通过迈克尔加成反应将丙烯酸酯化的三嵌段聚合物接枝到PEI的伯氨基上,并通过调整嵌段PEG、s-CL和PEI三者的比例得到三种不同分子量的五嵌段聚合物PEI-PCL-PEG-PCL-PEI.分别采用1H-NMR 、FT-IR对五嵌段聚合物PEI-PCL-PEG-PCL-PEI合成过程中的三种产物的结构进行表征,并计算相应五嵌段聚合物的相对分子质量。利用芘荧光法测定三种五嵌段聚合物纳米溶液的临界聚集浓度(CAC)。2.不同分子量PEI-PCL-PEG-PCL-PEI载INS纳米粒的制备及测定考虑到五嵌段聚合物的溶解性,采用溶剂挥发法制备聚合物载INS纳米粒。在预实验的基础上考察不同分子量PEI-PCL-PEG-PCL-PEI载INS纳米粒在20%wt、33%wt和40%wt下的包封率和载药量,确定最佳投药比。并用马尔文粒度测定仪测定以最佳投药比制备的聚合物载INS纳米粒的平均粒径和多分散指数(PDI),并在透射电镜下观察其形态。3. PEI-PCL-PEG-PCL-PEI载INS纳米粒的体外释放作用及体内降血糖作用考察(1)精密称量适量INS原料药和冷冻干燥后的聚合物载INS纳米粒,分别置于PBS缓冲液(0.01 mol/L, pH=6.0),在(37±1)℃条件下恒温水浴,80 r/min匀速搅拌进行体外释放,同时保持漏槽条件。在预先规定的时间点取样,取样后立刻补充相同体积相同温度的新鲜介质。取得的样品在14000r/min条件下高速离心30 min之后取出上清液并用Bradford法测定INS的含量,计算规定时间内的药物累计释放率。扣除0-6h药物突释量对整个释放曲线模型拟合的影响,将6-48h的体外累积释药率数据按照零级动力学模型、一级动力学模型、Higuchi模型等7个释放模型进行拟合、分析,探讨相应INS制剂的体外释药机制。(2)采用小剂量连续多日腹腔注射链脲佐菌素的方法构建糖尿病小鼠模型。给糖尿病小鼠皮下注射PEI-PCL-PEG-PCL-PEI载INS纳米粒溶液后于预先规定的时间点尾静脉取血,立即用自动血糖仪检测血糖值,最终评价载INS纳米粒的体内降血糖效果。结果1.不同分子量五嵌段聚合物PEI-PCL-PEG-PCL-PEI的合成与表征合成了三种不同分子量的五嵌段聚合物PEI-PCL-PEG-PCL-PEI.运用]H-NMR、FT-IR对五嵌段聚合物三步反应中的中间产物和终产物即三嵌段聚合物PCL-PEG-PCL、丙烯酸酯封端的PCL-PEG-PCL和五嵌段聚合物PEI-PCL-PEG-PCL-PEI进行结构表征,1H-NMR、FT-IR均证实最终目标产物-五嵌段聚合物含有PEG嵌段、PCL嵌段、PEI嵌段的特征峰。采用H-NMR谱图中相关特征峰的积分面积比计算得目标五嵌段聚合物即PEI10K-PCL4K-PEG2K-PCL4K-PEI1OK、PEI10K-PCL5K-PEG2K-PCL5K-PEI1OK、 PEI10K-PCL6K-PEG2K-PCL6K-PEI1OK的相对分子质量分别为30255、30299和33735,与理论值较接近。采用芘荧光法测得上述三种五嵌段聚合物的的临界聚集剂浓度值分别为10.96×10-4g/L、8.13×10-4g/L和6.17×10-4g/L,随着疏水嵌段PCL的增加,临界聚集浓度值依次减小,且均比普通小分子表面活性剂的CAC值低3-6个数量级,表明了五嵌段聚合物PEI-PCL-PEG-PCL-PEI在水中形成纳米粒子之后可自组装形成稳定的核壳结构。2.不同分子量PEI-PCL-PEG-PCL-PEI载胰岛素纳米粒的制备及测定利用溶剂挥发法制备聚合物载INS纳米粒。主要考察了投药比对载INS纳米粒包封率和载药量的影响,投药比为40wt%时,三种五嵌段聚合物载INS纳米粒的载药量均为最大。以该投药比制备的PEI10K-PCL4K-PEG2K-PCL4K-PEI1OK载INS纳米粒、PEI10K-PCL5K-PEG2K-PCL5K-PEI1OK载INS纳米粒和PEI10K-PCL6K-PEG2K-PCL6K-PEI1OK载INS纳米粒的粒径分别为(175.3±19.51) nm, (242.7±12.20) nm, (352.5±10.7) nm,多分散度指数(PDI)分别是0.415,0.783,0.694,且上述三种载INS纳米粒的形态在透射电镜下均呈明显的球状结构。3. PEI-PCL-PEG-PCL-PEI载INS纳米粒的体外释放作用及体内降血糖作用考察体外释放实验中,以PEI10K-PCL6K-PEG2K-PCL6K-PEI1OK载INS纳米粒的体外缓释效果为最佳,其在0-6h的药物累计释放量为15.42%,24 h末的药物累积释放率为22.52%,48 h末的药物累计释放量为27.66%,其在突释阶段的释药量明显少于INS原料药和本课题组在前期实验中制备的mPEG5k-PCL20k载INS纳米粒,一定程度上说明以PEI-PCL-PEG-PCL-PEI为载体制得的的载药纳米粒可达到降低药物突释效应及延缓药物释放的目的。体外释药模型拟合结果表明PEI-PCL-PEG-PCL-PEI载INS纳米粒在前6h的体外释药行为与Higuchi释放模型的拟合效果最好,在释药后期即6-48h内,上述三种载INS纳米粒的体外释药行为均与Weibull释放模型的拟合效果最好,相关系数r分别为0.9932、0.9817、0.9889,提示五嵌段聚合物载INS纳米粒的体外释放有延缓。体内降血糖实验显示三种五嵌段聚合物载INS纳米粒均有一定的降血糖作用,其中以PEI10K-PCL5K-PEG2K-PCL5K-PEI1OK载INS纳米粒和的PEI10K-PCL6K-PEG2K-PCL6K-PEI1OK载INS纳米粒的降血糖作用更明显,可维持12 h或更长时间。结论本文制得的五嵌段聚合物载INS纳米粒理化性质较好,包封率和载药量较高,体外缓释效应明显且突释阶段药物释放量减少,同时体内降血糖作用较好,降血糖作用相对平稳且维持时间较长,可避免短时间内迅速大量释药而造成患者出现不良反应,故为INS的制剂开发提供了一定参考。