第一部分IgA肾病患者血浆可溶性尿激酶受体水平与局部节段性肾小球硬化样病理改变发生相关[目的]已有研究报道可溶性尿激酶受体(soluble urokinase receptor, suPAR)与局部节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)的病理发生可能相关。本研究将分析suPAR是否参与1gA肾病患者的FSGS样病理改变。[方法]检测138例IgA肾病患者血浆suPAR水平,然后分析它们的临床及病理相关性。[结果]我们发现无论是通过单变量分析还是多变量分析IgA肾病患者血浆suPAR值均与年龄和肾功能显著性相关。通过多变量分析发现,女性血浆suPAR水平更高,血浆suPAR水平与患者IgA肾病患者24小时尿蛋白水平和血浆超敏C反应蛋白之间没有显著的相关性。在我们的1gA肾病患者队列中,60例患者病理切片中包含FSGS样病理改变。通过单变量和多变量分析发现,与不伴FSGS样病理改变的IgA肾病患者相比,伴FSGS样病理改变的IgA肾病患者有着显著升高的血浆suPAR水平。血浆suPAR值也可以成为区分IgA肾病患者是否伴有FSGS改变的有效因子。最佳的分界值为1806 pg/ml。同样无论单变量分析还是多变量分析我们都发现血浆suPAR浓度均与肾小管萎缩/间质纤维化程度显著性相关。多变量分析中,血浆suPAR水平与肾小球新月体形成百分比显著相关,与肾小球球性硬化百分比和动脉损伤程度无关。[结论]该研究的结果表明IgA肾病患者血浆suPAR水平显著性相关于年龄,性别,肾功能,肾小球萎缩/间质纤维化程度和新月体形成百分比。在中国IgA肾病患者中,血浆suPAR可能是判断FSGS样病理改变是否存在的潜在预测因子。第二部分尿激酶受体蛋白提高小鼠原代足突细胞运动能力的研究[目的]根据我们前期研究循环suPAR水平与IgA肾病患者FSGS样病理改变相关的结果,继续明确uPAR蛋白对足细胞的影响。[方法]应用免疫荧光及流式细胞学技术鉴定所提取小鼠原代足突细胞的纯度。运用划痕实验及迁移实验检测uPAR蛋白对小鼠原代足细胞运动能力的影响。并且,运用western blot技术检测各实验组原代足细胞运动相关蛋白的表达。[结果]所提小鼠原代足细胞均高表达足细胞特异蛋白Nephrin、Synaptopodin及WT-1,流式细胞仪检测细胞纯度为98.4%。划痕实验结果发现,与正常对照组相比,10μg/ml uPAR重组蛋白显著性增强小鼠原代足细胞24小时及48小时内的运动能力(P<0.05)。迁移实验结果表明,与正常对照组相比,5μg/ml(P<0.05)及10μg/ml(P<0.01)uPAR重组蛋白均显著性增强小鼠原代足细胞24小时及48小时内的迁移能力。同时,10μg/ml uPAR蛋白可显著性增加原代足细胞RhoA、Rac1及Cdc42蛋白水平的表达,并且可显著性降低其Nephrin蛋白水平的表达。[结论]通过对RhoA、Rac1及Cdc42蛋白水平表达的调节,uPAR蛋白可以促进小鼠原代足细胞运动能力的增强。第三部分尿激酶受体在不同环境下影响小鼠系膜细胞增殖能力的研究[目的]肾小球系膜细胞增生,凋亡及细胞外基质沉积是多种肾脏疾病中常见的病理改变。尿激酶受体是一种多功能胞膜外蛋白,具有促进或抑制细胞增殖的多重作用。本研究将明确尿激酶受体对于肾小球系膜细胞的具体作用。[方法]运用MTT及Brdu方法分别于正常、高糖或血清饥饿培养条件下分析uPAR重组蛋白对小鼠系膜细胞增殖能力的影响。应用Western blot实验技术检测不同处理组系膜细胞增殖相关蛋白的表达情况,包括AKT、P-AKT、MEK、P-MEK、ERK及P-ERK蛋白的表达。同样运用MTT技术分析整合素抑制肽RGD对各组细胞增殖能力的影响。[结果]5μg/ml及10μg/ml浓度水平uPAR显著性降低正常培养小鼠系膜细胞24小时及48小时内的增殖能力。与正常对照组相比,高糖及血清饥饿处理24小时或48小时内均导致系膜细胞增殖能力显著性降低。uPAR重组蛋白的干预显著促进高糖环境下小鼠系膜细胞增殖能力抑制水平。相反,uPAR重组蛋白的干预促进血清饥饿环境下小鼠系膜细胞的增殖水平。10μg/ml浓度的uPAR蛋白作用最为显著。与此相对应,与单纯高糖处理组相比,10μg/ml uPAR重组蛋白显著性降低高糖处理小鼠系膜细胞P-AKT、MEK、P-MEK及P-ERK蛋白表达水平。相反,与单纯血清饥饿处理组相比,10μg/ml uPAR重组蛋白显著性提高血清饥饿处理小鼠系膜细胞P-AKT、MEK、 P-MEK及P-ERK蛋白表达水平。AKT及ERK蛋白表达水平均没有发生显著性改变。整合素抑制肽RGD可以显著性降低uPAR重组蛋白对血清饥饿环境下小鼠系膜细胞的促增殖能力(P<0.05)。然而,对uPAR重组蛋白促进高糖环境下小鼠系膜细胞增殖抑制过程,RGD没有显著性拮抗作用。[结论]通过对P-AKT、MEK、P-MEK及P-ERK蛋白表达的不同调节,uPAR对高糖环境下系膜细胞具有抑制增殖作用,而对血清饥饿环境下系膜细胞具有促进增殖作用。uPAR的促进血清饥饿培养条件下小鼠系膜细胞增殖的过程需要整合素蛋白的参与。第四部分uPAR蛋白与补体系统激活相互作用性研究[目的]前期研究表明补体通路的激活及血浆suPAR水平均与IgA肾病患者FSGS样病理改变相关,本研究将观察补体系统的激活与suPAR的表达是否相关。[方法]检测210例IgA肾病患者血浆suPAR水平,并与患者肾小球系膜区C3沉积行相关性分析。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测小鼠系膜细胞及原代足细胞C3aR及C5aR mRNA表达。运用Western blot技术分析不同浓度uPAR蛋白对小鼠系膜细胞及原代足细胞C3aR及C5aR蛋白表达的影响,及不同浓度C3a及C5a蛋白对小鼠系膜细胞及原代足细胞uPAR蛋白表达的影响。[结果]肾小球系膜区补体C3沉积3+～4+的IgA肾病患者血浆suPAR浓度显著性高于C3沉积2+IgA肾病患者血浆suPAR水平(P<0.001)及C3沉积0～1+的IgA肾病患者血浆suPAR水平(P<0.0001)。小鼠系膜细胞及原代足细胞均有C3aR及C5aRmRAN表达。与正常对照组相比,uPAR蛋白可以显著性增加小鼠系膜细胞及原代足细胞C3aR及C5aR蛋白的表达,且呈剂量依赖性。反过来,补体C3a及C5a也可显著性增加小鼠系膜细胞及原代足细胞uPAR蛋白水平的表达,也呈剂量依赖性。[结论]在肾脏疾病系统中,uPAR蛋白的表达与补体系统的激活可能存在相互作用的关系。