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绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)是国家卫生部公布的药食两用植物。绞股蓝茶是将芽及幼嫩茎叶经过萎凋、杀青、揉捻和干燥等工艺加工制成的天然保健茶饮。因其富含皂苷、多糖、黄酮等活性物质,具有明显的降血脂,抗衰老和提高免疫力等保健功效,且长期饮用对人身体无任何副作用,故有“第二人参”的美称。目前针对绞股蓝茶的研究主要集中在皂苷的功效和作用机制,而对绞股蓝茶多糖的研究报道较少。鉴于此,本文以绞股蓝茶多糖作为研究对象,对其进行提取和分离纯化,并对三种多糖组分(GTPP-1,GTPP-2和GTPP-3)的理化性质及结构、抗氧化活性及对RAW264.7细胞的免疫调节活性进行研究和比较,并主要研究了GTPP-3的免疫调节活性作用机制。主要结论如下:(1)利用超声波辅助热水浸提法提取绞股蓝茶多糖,其得率为4.25%。采用Cellulose DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-150葡聚糖凝胶柱层析对绞股蓝茶粗多糖进行分离纯化,得到三种纯化多糖组分GTPP,分别命名为GTPP-1,GTPP-2和GTPP-3。(2)通过 UV、HPLC-UY、HPGPC、FT-IR、SEM、刚果红实验和 I2-KI 实验等方法初步研究了三种组分多糖的理化特性、结构特征和抗氧化活性。GTPP-1、GTPP-2和GTPP-3中的总糖含量分别为99.68%、99.29%和99.47%,糖醛酸含量分别为17.3%、18.75%、20.05%。紫外光谱分析结果中,三种组分多糖在260 nm和280 nm处均无明显的吸收峰,表明不含核酸和蛋白质。通过高效液相色谱进行了单糖组成的检测分析,结果表明:GTPP-1、GTPP-2和GTPP-3是均为以甘露糖、葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸为主要成分的酸性杂多糖。经高效凝胶渗透色谱分析表明,三种组分为纯度均一的多糖,且分子量分别为1695kDa,1723kDa和2485kDa。红外光谱分析结果表明,在三种组分多糖在指纹区均存在吡喃糖环的特征吸收峰。扫描电子显微镜的结果表明,GTPP-1多为平滑片状、不规则杆状结构及少量球状结构;GTPP-2主要为网状结构;而GTPP-3呈现孔状和网状两种结构。刚果红实验结果表明,GTPP-3含有三螺旋结构。I2-KI实验结果表明,三种组分多糖可能存在较长的侧链或较多的支链。此外,三种组分多糖均具有一定的抗氧化活性,且其活性顺序依次为:GTPP-3>GTPP-2>GTPP-1。(3)分别使用既定剂量的GTPP-1、GTPP-2和GTPP-3对RAW264.7细胞进行孵育,通过细胞形态、增殖和吞噬能力、一氧化氮(NO)及细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)分泌水平等指标,评价绞股蓝茶多糖的免疫调节活性。结果表明,巨噬细胞经GTPP三种组分多糖刺激后,体积略微增大,细胞边缘长出伪足,表现出活化巨噬细胞的明显形态特征。GTPP各组分多糖均对巨噬细胞无毒性作用,并且可增强其吞噬能力,对NO和TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子的分泌量均有显著促进作用,其中GTPP-3的免疫调节能力相对较好。(4)通过Western blot和免疫荧光染色技术,初步研究了 GTPP-3激活RAW264.7细胞的作用机理。TLR4受体阻断剂能抑制GTPP-3诱导的RAW264.7细胞NO和TNF-α的产生,表明TLR4参与了 GTPP-3激活巨噬细胞。Western Blot分析结果表明,GTPP-3可诱导TLR4下游pERK1/2、JNK、p38和Akt的磷酸化以及NF-κBp65的核移位,而以上五种蛋白的特异性抑制剂,显著抑制了 GTPP-3对巨噬细胞产生NO和TNF-α的诱导作用,证明GTPP-3通过MAPKs、PI3K/Akt和NF-kB信号通路激活巨噬细胞。