论文部分内容阅读
肌醇(myo-inositol,MI)是生物体中广泛分布的一种小分子多元醇类,它参与生命活动的各个重要方面。MI经过反应生成磷脂酰肌醇磷酸(PtdIns P)、磷酸肌醇(InsP),它们是特定的鞘脂类信号分子,在许多过程中起作用,如调节基因表达、磷的贮存、生长素和受体的联系、膜的束缚、胁迫抗性、多糖合成(肌醇半乳糖苷)以及细胞凋亡的调节(鞘脂类)。MI的氧化产物(D-葡萄糖醛酸)可以作为合成细胞壁果胶的非纤维素化合物,并且在一些生物中能够合成抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)-植物细胞中一种主要的抗氧化剂。MI及其甲基化衍生物还可作为渗透调节物质参与生物体的渗透调节。由此可见MI的合成和代谢影响着植物体内许多关键的生化途径。MI是猕猴桃中最主要的糖类物质之一,占其果实总糖分的20%-60%,构成了猕猴桃果实重要的品质性状。MI的合成途径在所有生物体中都是相同的。D-葡萄糖-6-磷酸在肌醇-1-磷酸合酶(MIPS)的作用下生成肌醇-1-磷酸,然后再在肌醇单磷酸酶的作用下生成游离的MI。其中MIPS是反应的关键限速酶。MI降解的关键酶是肌醇加氧酶(MIOX),MI在MIOX的作用下生成D-葡萄糖醛酸,参与后续的各种反应。本研究以美味猕猴桃品种‘秦美’(Actinidia deliciosa cv.‘QinMei’)、毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)、山梨猕猴桃(Actinidia rufa)和软枣猕猴桃(Actinidia arguta)为材料,克隆获得了MIPS序列,并分析了在干旱和盐胁迫处理下美味猕猴桃MIPS基因的表达和酶活性变化;比较了不同种猕猴桃果实发育期MIPS基因和酶活性的变化以及MIPS基因在不同猕猴桃组织中的表达情况;测定了果实发育期不同种猕猴桃MI及其他几种可溶性糖的含量变化。对美味猕猴桃MIPS进行了RNA干扰的研究。通过RACE技术,克隆并获得了美味猕猴桃MIOX基因3’序列和5’部分序列,研究了MIOX在几个猕猴桃种不同组织中的表达情况。获得的主要结果如下:1.从美味、山梨、毛花和软枣猕猴桃中克隆获得MIPS基因序列,它们的最大开放阅读框都是1533 bp,编码510个氨基酸,蛋白质分子量为56.3 kD。将获得的MIPS基因序列分别命名为AdMIPS(美味猕猴桃)、ArMIPS(山梨猕猴桃)、AeMIPS(毛花猕猴桃)和AaMIPS(软枣猕猴桃)并登陆Genbank,登陆号分别为:KF114872(A.arguta)、KF114869(A.eriantha)、KF114870(A.rufa)和JX122766(A.deliciosa)。利用生物信息学软件对序列的等电点、亲水性、二级结构和三维结构进行了分析和预测。获得的氨基酸序列具有很高的相似性,可达到98.94%,和其他物种中的MIPS氨基酸序列进行多重比对发现猕猴桃MIPS序列具有很高的保守性。MIPS基因在猕猴桃多个组织中都表达,幼果期的MIPS转录水平和酶活性都是整个果实发育期的最高值,几种猕猴桃的趋势基本一致。2.检测了美味、毛花、山梨和软枣猕猴桃果实发育期的MI、蔗糖、葡萄糖和果糖的变化趋势,在美味、毛花和山梨猕猴桃中MI含量均低于其他糖类的含量,而在软枣猕猴桃中MI的含量在幼果期时为其他糖类的大约6倍。对MI/蔗糖和MI/(葡萄糖+果糖)进行计算,发现软枣猕猴桃的这两个比例也高于其他三个猕猴桃种。结果表明,MI是软枣猕猴桃幼果期主要的糖类,并且软枣猕猴桃从蔗糖、葡萄糖和果糖转化到MI的效率可能高于其他种。3.以美味猕猴桃为材料,研究了自然干旱和盐胁迫下MIPS基因的表达和酶活性的变化。结果表明,在干旱处理下AdMIPS的基因表达表现出先升高后降低的趋势,而酶活性在处理期间一直降低;在不同时间盐胁迫处理下AdMIPS的基因表达和酶活性都呈现出先升高后降低的趋势,而在不同盐浓度处理下猕猴桃叶片、韧皮部和根中的AdMIPS基因表达和酶活性受到不同程度的诱导,结果显示AdMIPS能够响应干旱和盐胁迫,预示着美味猕猴桃MI在逆境胁迫中的重要作用。4.构建了AdMIPS基因的干扰表达载体,并转化美味猕猴桃‘秦美’。经过转化和筛选获得对卡那霉素有抗性的阳性株系。对阳性株系的DNA和cDNA进行了PCR检测,可发现相应的条带。Southern杂交检测结果表明干扰片段成功整合到美味猕猴桃基因组中。对猕猴桃3个转基因株系进行移栽成活以后检测其叶片的MI和AsA含量的变化,结果显示与未转化植株相比,转基因株系的MI含量降低,而AsA含量则高于未转化植株,预示着MI和AsA代谢途径中复杂的变化。对转基因猕猴桃进行干旱和NaCl胁迫处理,结果表明这两种胁迫下转基因株系的MI含量和抗逆性均低于未转化植株。5.通过RACE技术,对Genbank中预测的猕猴桃MIOX4 EST序列进行5’和3’端的扩增。通过巢式PCR获得较清晰的扩增条带,测序后进行序列拼接,获得一个1255 bp的长序列。对不同种猕猴桃中MIOX4的基因表达进行实时定量分析,发现其在美味和毛花猕猴桃花中的表达量最高。