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本研究运用分子生物学技术构建野生型、单点变异和双点变异型重组质粒表达载体，并转染人胚肺成纤维细胞(HLF)，建立起有效的细胞模型，探讨变异型细胞模型对3-MC毒作用的影响，揭示CYP1A1血红素结合区域氨基酸与其代谢功能关系。
主要研究内容和方法：
一、野牛型CYP1A1 cDNA全长基因T载体的构建和鉴定用TRIZOL试剂从人乳腺癌细胞株MCF-7中抽提总RNA，进行逆转录反应生成总cDNA；利用自行设计的两对特异性引物，采用巢式聚合酶链式反应扩增CYP1A1基因的cDNA全长序列，通过T载体克隆，酶切和测序鉴定确证。
二、CYP1A1活性结构域附近Thr<461>→Asn<461>、Ile<462>→Val<462>定点突变及T载体克隆自行设计含突变碱基(1504C→A，1506A→G)的两对引物，采用重叠延伸PCR方法对野生型CYP1A1基因进行1504C→A单点和1504C→A/1506A→G双点的定点突变，通过T载体克隆、酶切鉴定和测序确证。
三、CYP1A1-Wt和CYP1A1-Asn<461>，-Val<462>真核表达载体的构建及细胞模型建立将构建的CYP1A1野生型和-Asn<461>，-Val<462>变异型T载体双酶切，重组至真核表达的逆转录病毒pBABE-neo载体上，通过PCR及BamHI/SalI双酶切确证。利用FuGENE6转染试剂盒，将构建的野生型和变异型CYP1A1表达载体转染至人胚肺成纤维细胞(HLF)，用1000μg/ml G418筛选转染细胞。用免疫蛋白印迹法(Western Blotting)检测转染细胞CYP1A1蛋白的表达，观察比较转染细胞和未转染细胞的生长形态、超微结构、生长速度、软琼脂培养生长状况等生物学特性，了解转染细胞对人体正常细胞生物学特性的影响。
四、3-MC对CYP1A1 Asn<461>及Val<462>变异细胞模型作用的研究首先观察0，0.1，0.5，2.5，12.5，72.5μmol/L 3-MC对正常HLF细胞作用24h后CYP1A1蛋白表达和活性的影响，并确定转染细胞的染毒剂量；用2.5μmol/L 3-MC对转染和未转染细胞染毒24h，观察CYP1A1蛋白表达量和活性，细胞微核率、核异常率。
研究结果：
一、野生型CYP1A1 eDNA全长基因T载体的构建和鉴定根据Genebank中CYP1A1 mRNA序列设计两对引物(P1/P2，P3/P4)，其中上游内引物(P3)的5’端引入BamHI内切酶位点，下游内引物(P4)5’端引入SalI内切酶位点，确定扩增目的序列中没有此两个酶切位点。抽提培养的MCF-7细胞总RNA，电泳观察完整性，进行逆转录反应获得cDNA；首先用P1/P2引物扩增出含目的片断在内的1703bp片断，以此为模板，用P3/P4扩增出CYP1A1 cDNA全长1541bp的目的片断。
将扩增产物与T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH<,5α>，筛选阳性克隆，提取重组质粒后，PCR扩增，得到预期的1.5kb片断。用BamHI和Sail对重组质粒进行酶切分析，得到1.5kb和3.0kb片断；测序结果与Genebank中CYP1A1基因cDNA序列比较，符合率达99.9﹪，证实插入的片断为目的片断。将此质粒命名为“pGEM-T-CYPlAl”。
二、CYPlAl活性结构域附近Thr<461>→Asn<461>、Ile<462>→Val<462>定点突变及T载体克隆根据人群研究的资料，确定CYP1A1 mRNA的1504、1506碱基为突变的目标碱基，设计两对含1504、1506突变碱基的引物(Pt1/Pt2，Pt3/Pt4)与扩增目的片断的引物(P3/P4)共组成了五对引物，应用PCR技术先分别得到含单点Asn<461>，双点Asn<461>/Val<462>变异的1397bp上游片断和177bp的下游片断，以此上下游片断为模板，采用P3/P4引物扩增得到含突变位点的全长CYP1A1 cDNA。扩增产物与T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5<,5α>，筛选阳性克隆，提取重组质粒后，PCR扩增得到1.5kb片断；用BamHI和Sail对重组质粒进行酶切分析得到1.5kb和2.6kb两个片断，将酶切鉴定正确的质粒用T载体通用引物测序，结果与Genebank中CYP1A1基因cDNA序列比较，确证成功将目标位点进行了单点1504C→A和双点1504C→A/1506A→G突变。将此两个质粒分别命名为“pMD-T-Asn<461>”和“pMD-T-Asn-T-Asn<461>/Val<462>”。
三、CYP1A1-Wt和CYP1A1-Asn<461>，-Val<462>真核表达载体的构建及细胞模型建立。
四、3-MC对CYP1A1 Asn<461>/Val<462>变异细胞模型作用的研究
1.3-MC对正常HLF细胞CYP1A1表达及EROD的影响3-MC可以诱导正常细胞表达CYP1A1蛋白，且有一定的剂量——效应关系：3-MC可以增高HLF细胞EROD活性，各组方差检验F=36.092，P<0.01；LSD检验，2.5μmol/L以上染毒组与对照组比，均P<0.05：存在明显的剂量——效应关系，r=0.850(P<0.05)。因此确定3-MC的2.5μmol/L浓度为转染细胞染毒剂量。
2.转染细胞CYP1A1蛋白表达及EROD活性的影响未转染HLF和转染的HLF细胞CYP1A1蛋白表达有差异(见三、1)。EROD活性的测定发现，未转染HLF细胞与空载体转染细胞HLF-pBABE比差异无统计学意义(P>0.05)；HLF-Wt和HLF-Asn<461>/Val<462>细胞EROD与HLF和HLF-pBABE细胞相比差异有统计学意义(P<0.05)；但HLF-Asn<461>细胞的EROD与两个对照组细胞相比差异无统计学意义(P>0.05)：HLF-Asn<461>细胞的EROD与HLF-Wt比差异也无统计学意义(P>0.05)，但HLF-Asn<461>/Val<462>细胞EROD显著高于HLF-Wt(P<0.05)。提示单点和双点变异型基因转染对HLF细胞代谢功能产生了不同影响。
3-3-MC对HLF-Asn<461>和HLF-Asn<461>/val<462>细胞蛋白表达及EROD活性的影响3-MC对转染细胞染毒24h后，野生型HLF-Wt与变异型HLF-Asn<461>、HLF-Asn<461>/Val<462>细胞的CYP1A1蛋白表达没有显著性差异。转染细胞染毒后HLF-Asn<461>细胞EROD活性比HLF-Wt低，两者有显著性差异(P<0.05)；HLF-msn<461>/Val<462>细胞EROD活性高于野生型HLF-Wt细胞(P<0.05)。提示Thr<461>→Asn<461>单点变异和Thr<461>→Asn<461>→Ile<462>→Val<462>双点变异改变了HLF对3-MC的代谢。
4-3-MC对细胞微核率和核异常率的比较用2.5μmol/L 3-MC对野生型和变异型细胞染毒24h后，变异型细胞组微核率、核异常率与野生型细胞组比无显著性差异(P>0.05)，而与各自阴性未染毒组比则有显著增高(P<0.01)。各转染组与正常HLF细胞相比，微核率和核异常率明显增加(P<0.01)，提示3-MC的作用将会对细胞的遗传物质DNA产生明显损伤，且无需外加S9活化系统，在2.5μmol/L剂量就能诱发HLF细胞微核显著增加，证明了转染CYPlAl的HLF细胞对3-MC的损伤更加敏感。