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本研究运用分子生物学技术构建野生型、单点变异和双点变异型重组质粒表达载体,并转染人胚肺成纤维细胞(HLF),建立起有效的细胞模型,探讨变异型细胞模型对3-MC毒作用的影响,揭示CYP1A1血红素结合区域氨基酸与其代谢功能关系。
主要研究内容和方法:
一、野牛型CYP1A1 cDNA全长基因T载体的构建和鉴定用TRIZOL试剂从人乳腺癌细胞株MCF-7中抽提总RNA,进行逆转录反应生成总cDNA;利用自行设计的两对特异性引物,采用巢式聚合酶链式反应扩增CYP1A1基因的cDNA全长序列,通过T载体克隆,酶切和测序鉴定确证。
二、CYP1A1活性结构域附近Thr<461>→Asn<461>、Ile<462>→Val<462>定点突变及T载体克隆自行设计含突变碱基(1504C→A,1506A→G)的两对引物,采用重叠延伸PCR方法对野生型CYP1A1基因进行1504C→A单点和1504C→A/1506A→G双点的定点突变,通过T载体克隆、酶切鉴定和测序确证。
三、CYP1A1-Wt和CYP1A1-Asn<461>,-Val<462>真核表达载体的构建及细胞模型建立将构建的CYP1A1野生型和-Asn<461>,-Val<462>变异型T载体双酶切,重组至真核表达的逆转录病毒pBABE-neo载体上,通过PCR及BamHI/SalI双酶切确证。利用FuGENE6转染试剂盒,将构建的野生型和变异型CYP1A1表达载体转染至人胚肺成纤维细胞(HLF),用1000μg/ml G418筛选转染细胞。用免疫蛋白印迹法(Western Blotting)检测转染细胞CYP1A1蛋白的表达,观察比较转染细胞和未转染细胞的生长形态、超微结构、生长速度、软琼脂培养生长状况等生物学特性,了解转染细胞对人体正常细胞生物学特性的影响。
四、3-MC对CYP1A1 Asn<461>及Val<462>变异细胞模型作用的研究首先观察0,0.1,0.5,2.5,12.5,72.5μmol/L 3-MC对正常HLF细胞作用24h后CYP1A1蛋白表达和活性的影响,并确定转染细胞的染毒剂量;用2.5μmol/L 3-MC对转染和未转染细胞染毒24h,观察CYP1A1蛋白表达量和活性,细胞微核率、核异常率。
研究结果:
一、野生型CYP1A1 eDNA全长基因T载体的构建和鉴定根据Genebank中CYP1A1 mRNA序列设计两对引物(P1/P2,P3/P4),其中上游内引物(P3)的5’端引入BamHI内切酶位点,下游内引物(P4)5’端引入SalI内切酶位点,确定扩增目的序列中没有此两个酶切位点。抽提培养的MCF-7细胞总RNA,电泳观察完整性,进行逆转录反应获得cDNA;首先用P1/P2引物扩增出含目的片断在内的1703bp片断,以此为模板,用P3/P4扩增出CYP1A1 cDNA全长1541bp的目的片断。
将扩增产物与T载体连接,转化感受态大肠杆菌DH<,5α>,筛选阳性克隆,提取重组质粒后,PCR扩增,得到预期的1.5kb片断。用BamHI和Sail对重组质粒进行酶切分析,得到1.5kb和3.0kb片断;测序结果与Genebank中CYP1A1基因cDNA序列比较,符合率达99.9﹪,证实插入的片断为目的片断。将此质粒命名为“pGEM-T-CYPlAl”。
二、CYPlAl活性结构域附近Thr<461>→Asn<461>、Ile<462>→Val<462>定点突变及T载体克隆根据人群研究的资料,确定CYP1A1 mRNA的1504、1506碱基为突变的目标碱基,设计两对含1504、1506突变碱基的引物(Pt1/Pt2,Pt3/Pt4)与扩增目的片断的引物(P3/P4)共组成了五对引物,应用PCR技术先分别得到含单点Asn<461>,双点Asn<461>/Val<462>变异的1397bp上游片断和177bp的下游片断,以此上下游片断为模板,采用P3/P4引物扩增得到含突变位点的全长CYP1A1 cDNA。扩增产物与T载体连接,转化感受态大肠杆菌DH5<,5α>,筛选阳性克隆,提取重组质粒后,PCR扩增得到1.5kb片断;用BamHI和Sail对重组质粒进行酶切分析得到1.5kb和2.6kb两个片断,将酶切鉴定正确的质粒用T载体通用引物测序,结果与Genebank中CYP1A1基因cDNA序列比较,确证成功将目标位点进行了单点1504C→A和双点1504C→A/1506A→G突变。将此两个质粒分别命名为“pMD-T-Asn<461>”和“pMD-T-Asn-T-Asn<461>/Val<462>”。
三、CYP1A1-Wt和CYP1A1-Asn<461>,-Val<462>真核表达载体的构建及细胞模型建立。
四、3-MC对CYP1A1 Asn<461>/Val<462>变异细胞模型作用的研究
1.3-MC对正常HLF细胞CYP1A1表达及EROD的影响3-MC可以诱导正常细胞表达CYP1A1蛋白,且有一定的剂量——效应关系:3-MC可以增高HLF细胞EROD活性,各组方差检验F=36.092,P<0.01;LSD检验,2.5μmol/L以上染毒组与对照组比,均P<0.05:存在明显的剂量——效应关系,r=0.850(P<0.05)。因此确定3-MC的2.5μmol/L浓度为转染细胞染毒剂量。
2.转染细胞CYP1A1蛋白表达及EROD活性的影响未转染HLF和转染的HLF细胞CYP1A1蛋白表达有差异(见三、1)。EROD活性的测定发现,未转染HLF细胞与空载体转染细胞HLF-pBABE比差异无统计学意义(P>0.05);HLF-Wt和HLF-Asn<461>/Val<462>细胞EROD与HLF和HLF-pBABE细胞相比差异有统计学意义(P<0.05);但HLF-Asn<461>细胞的EROD与两个对照组细胞相比差异无统计学意义(P>0.05):HLF-Asn<461>细胞的EROD与HLF-Wt比差异也无统计学意义(P>0.05),但HLF-Asn<461>/Val<462>细胞EROD显著高于HLF-Wt(P<0.05)。提示单点和双点变异型基因转染对HLF细胞代谢功能产生了不同影响。
3-3-MC对HLF-Asn<461>和HLF-Asn<461>/val<462>细胞蛋白表达及EROD活性的影响3-MC对转染细胞染毒24h后,野生型HLF-Wt与变异型HLF-Asn<461>、HLF-Asn<461>/Val<462>细胞的CYP1A1蛋白表达没有显著性差异。转染细胞染毒后HLF-Asn<461>细胞EROD活性比HLF-Wt低,两者有显著性差异(P<0.05);HLF-msn<461>/Val<462>细胞EROD活性高于野生型HLF-Wt细胞(P<0.05)。提示Thr<461>→Asn<461>单点变异和Thr<461>→Asn<461>→Ile<462>→Val<462>双点变异改变了HLF对3-MC的代谢。
4-3-MC对细胞微核率和核异常率的比较用2.5μmol/L 3-MC对野生型和变异型细胞染毒24h后,变异型细胞组微核率、核异常率与野生型细胞组比无显著性差异(P>0.05),而与各自阴性未染毒组比则有显著增高(P<0.01)。各转染组与正常HLF细胞相比,微核率和核异常率明显增加(P<0.01),提示3-MC的作用将会对细胞的遗传物质DNA产生明显损伤,且无需外加S9活化系统,在2.5μmol/L剂量就能诱发HLF细胞微核显著增加,证明了转染CYPlAl的HLF细胞对3-MC的损伤更加敏感。