缺血性脑卒中是成年人死亡和致残的主要原因。迄今为止,FDA批准的唯一治疗缺血性脑卒中的药物是重组组织纤溶酶原激活剂（rtPA）,但其使用受限于4.5 h的狭窄时间窗和颅内出血的风险。大多数神经保护药物发现临床前研究与临床试验之间不匹配,部分原因是因为缺乏对慢性脑修复过程的观察。因此,找到有效的策略促进缺血性脑卒中后长期神经功能的恢复,而不仅仅是缺血后的超急性期对神经元损伤的保护,是十分必要的。脑卒中在灰质内主要引起神经元损伤,在脑白质内主要引起神经纤维损伤。脑缺血后,大脑开始启动漫长且复杂的自我修复机制,主要包括血管生成,神经发生,轴突出芽和突触再生。在损伤后的恢复过程中,白质中神经丝重新布线,促进缺血性脑卒中后大脑皮层功能的改善。在缺血性脑卒中领域的先前研究主要集中在对灰质神经元损伤的保护上。然而,研究发现灰质损伤的程度并不总是与行为功能缺损程度一致,脑白质功能的改善被证明与缺血后的神经功能恢复高度相关,因此,越来越多的研究着眼于干预白质中轴突可塑性。Sonic Hedgehog（Shh）,一种分泌的糖蛋白,是Hedgehog途径的内源性激动剂。Shh通过与其细胞表面受体Patched-1（Ptch-1）结合来启动Shh信号传导。当Shh蛋白存在时,Ptch-1失活并释放其对膜受体Smo的抑制。Smo促使转录因子Gli-1激活,并由细胞质转移到细胞核中,从而诱导Gli-1靶向基因的转录。我们最近的研究证明,内源性Hedgehog途径在缺血性脑卒中后被激活,在动物体内促进了脑室下区域的神经发生过程,并在体外神经元上促进了神经突的生长。同时,Shh信号通路的激活促进了缺血性脑卒中后的轴突再生。因此,Shh及其下游信号分子可以用作潜在的治疗靶标,以激发缺血性脑卒中后的轴突可塑性。脑蛋白水解物（cerebroprotein hydrolysate,CH）是衍生自纯化猪脑组织的低分子神经肽的混合物。脑蛋白水解物易于透过生物膜并具有透过血脑屏障的能力,这使CH成为临床应用的有效选择。在体内,已证明CH可促进神经再生,改善缺血性脑卒中后长期神经功能预后,减轻神经炎症,并抑制氧自由基形成。重要的是,几项针对患者的随机临床试验也揭示了 CH在脑卒中领域的治疗价值。然而,在缺血性脑卒中后,CH对白质中轴突可塑性的作用尚不清楚。在本研究中,我们试图探索一种新的脑蛋白水解产物,称为注射用脑蛋白水解产物（Ⅰ）（cerebroproteinhydrolysate 1,CH1）的潜在应用价值。我们采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,通过电凝法建立远端大脑中动脉闭塞（distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO）模型,旨在评估注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）是否可以改善缺血性脑卒中后神经功能并探讨其相关作用机制。在机制研究上我们探讨注射用脑蛋白水解物1是否通过激活shh/ptch/Gli-1通路调节缺血性脑卒中后的白质损伤。研究分为三个部分,各部分内容概括如下。第一部分 注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）对局灶性脑梗死小鼠神经功能恢复的作用目的:通过观察实验性脑梗死小鼠神经行为的变化,我们旨在评价CH1对卒中后神经功能恢复的作用,筛选CH1的有效剂量;通过观察实验性脑梗死小鼠脑梗死体积、脑萎缩体积、尼氏染色及NeuN染色,评价CH1对缺血性脑卒中后神经灰质损伤的影响。方法:采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,建立dMCAO模型。dMCAO小鼠术后即刻每天接受CH1（5 mg/kg,10 mg/kg,15 mg/kg溶解于生理盐水）腹腔注射直至取材或连续14天（每天1次）。实验（1）分组:随机将C57BL/6小鼠分为4组:溶剂对照组（Vehicle组）:动物接受dMCAO模型,和每日等体积的生理盐水腹腔注射;注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）低剂量组（CH1-L组）:动物接受dMCAO模型,并给予每日5 mg/kg CH1腹腔注射;注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）中剂量组（CH1-M组）:动物接受dMCAO模型,并给予每日10 mg/kg CH1腹腔注射;注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）高剂量组（CH1-H组）:动物接受dMCAO模型,并给予每日20 mg/kg CH1腹腔注射。分别于术前及术后3、7、14、21、28天进行跑轮实验、移除黏附物能力测试和mNSS神经功能评分。实验（2）分组:随机将C57BL/6小鼠分为3组:Sham组:动物接受假手术和每日等体积的生理盐水腹腔注射;Vehicle组:动物接受dMCAO模型,和每日等体积的生理盐水腹腔注射;CH1组:动物接受dMCAO模型,并给予每日10 mg/kg CH1腹腔注射;dMCAO术后14及28天应用TTC测定梗死体积;dMCAO术后14及28天应用皮层宽度指数（cortical width index,CWI）测定脑萎缩情况;dMCAO术后14和28天应用免疫荧光染色评价灰质神经元的存活情况,dMCAO术后14及28天应用尼氏染色评价神经元的活性。结果:1.注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）促进脑梗死后小鼠神经功能恢复,改善行为学评分1.1 Rotarod 实验在脑梗死模型后3天,各个组小鼠Rotarod实验的跑轮时间均明显减少,且各组之间没有统计学差异。从第7天开始,各个组小鼠的行为学功能均开始逐渐恢复。与Vehicle组小鼠相比,CH1-M和CH1-H组小鼠均在术后第14和28天具有明显的跑轮持续时间的延长（P<0.05）,CH1-M组在术后7天与Vehicle组小鼠相比具有统计学差异（P<0.05）。1.2 mNSS 评分梗死前各组小鼠mNSS评分均为0分,在脑梗死术后3天各组小鼠均发生了严重的神经功能缺损,且各组间无统计学差异。与Vehicle组相比,CH1（10 mg/kg）组在术后第7和14天显著降低dMCAO小鼠的神经功能缺损（P<0.05）,但是,CH1治疗对dMCAO小鼠术后28天的mNSS评分无明显影响。1.3移除黏附物能力测试于dMCAO术前及术后3天、7天、14天和28天对小鼠进行Adhesive removal test以评估自体感觉缺失,术后3天,各组实验小鼠受损脑区所支配的前肢均较术前表现出明显的自体感觉缺失,且各组小鼠接触及移除粘条时间无统计学差异,与Vehicle组相比,CH1-M组在术后14及28天表现出接触及移除粘条时间的缩短。CH1-H组在术后14天表现出接触粘条时间的缩短,在术后14及28天表现出移除粘条时间的缩短。上述结果表明,与Vehicle组相比,CH1给药剂量在10 mg/kg时能够表现出明显的神经功能改善,并且,这种改善作用主要表现在术后的恢复期。因此,后续实验我们将主要研究10 mg/kg的CH1在dMCAO术后14及28天的作用及其相关机制。2.注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）可减轻局灶性脑卒中小鼠脑梗死体积2.1脑梗死体积测定通过TTC染色法测定小鼠局灶性脑梗死造模成功后第14天与第18天脑梗死体积,结果显示:dMCAO术后第14天和28天TTC染色后,Vehicle和CH1组小鼠皮层呈现局灶性损伤,表现为多层面白色梗死区。与Vehicle组小鼠比较,CH1小鼠的脑梗死体积在术后14天减轻（P<0.05）。但是,在术后28天,CH1小鼠的脑梗死体积与Vehicle相比无统计学差异（P>0.05）。2.2脑萎缩体积测定与Vehicle组小鼠比较,CH1小鼠的脑萎缩体积在dMCAO术后14天减轻（P<0.05）。但是,在dMCAO术后28天,CH1小鼠的脑萎缩体积与Vehicle相比无统计学差异（P>0.05）。结论:1.本部分实验通过电凝法建立小鼠永久性远端大脑中动脉缺血模型,此模型操作简单、可重复性好、死亡率低、稳定性高,较好的模拟了人类缺血性脑卒中的发病过程,是理想的研究局灶性脑缺血的模型,尤其适合与脑卒中后恢复期的神经功能观察。2.通过对小鼠神经行为学和神经组织学的观测,发现CH1可以在脑缺血后的亚急性期和慢性期显著改善小鼠的运动神经功能。同时CH1可以在脑缺血后的慢性期减小脑梗死体积及脑萎缩。另外,CH1可透过血脑屏障,可能成为具有治疗前景的卒中用药。3.在脑缺血的慢性期（28 d）,CH1对梗死体积及脑皮质宽度未产生影响,但是对神经行为学有改善,我们需要继续探索这种不一致产生的原因。第二部分 注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）减轻局灶性脑梗死小鼠慢性期的脑白质纤维损伤,促进白质修复目的:通过上述实验可知,CH1在dMCAO术后14天和28天均可对小鼠的神经行为学功能有所改善,但是组织学测定表明,CH1仅对缺血后14天的脑梗死体积及脑萎缩有所改善,并未对28天的脑梗死体积及脑萎缩有所改善,因此,我们想要探究造成28天行为学功能与组织学染色之间差异的原因。我们猜测,是否CH1在慢性期对小鼠神经行为学功能的改善不是通过影响灰质引起的,而是通过影响白质引起的。因此,我们分别通过NeuN染色和Nissl染色测定了灰质的完整性,并且通过SMI-32/MBP染色测定了白质的完整性,通过BDA神经示踪测定了轴突的再生。方法:采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,建立dMCAO模型。dMCAO小鼠术后即刻每天接受中剂量的CH1（10mg/kg）,腹腔注射直至取材或连续14天（每天1次）。实验分组:采用随机的方法将C57BL/6小鼠分为3组:sham组:小鼠假手术后腹腔注射等量的生理盐水;Vehicle组:小鼠大脑中动脉远端闭塞后腹腔注射等量的生理盐水;注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）中剂量组（CH1组）:小鼠大脑中动脉远端闭塞后腹腔注射等量的10mg/kg CH1。分别于dMCAO术后14、28天进行NeuN染色和尼氏染色,于dMCAO术后28天进行SMI-32、MBP免疫荧光测定及BDA顺行示踪测定。结果:1.注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）对局灶性脑梗死小鼠术后28天的灰质完整性无影响。1.1 NeuN 染色我们通过NeuN染色评估局灶性脑缺血小鼠缺血半暗带区残存神经元的数量,结果显示:与sham组小鼠相比,缺血损伤会造成神经元数量的显著减少,结果具有统计学意义。与Vehicle组小鼠相比,CH1组在梗死后14天促进神经元存活,但是在28天灰质神经元的数量俩组相比没有统计学意义。1.2尼氏染色脑缺血后,细胞排列紊乱,Nissl体的数目显着减少,组织间隙增加并且细胞内形成许多液泡。与sham组相比,局灶性脑缺血后具有丰富Nissl体的神经元明显减少,脑缺血后第14天通过CH1给药使Nissl体减少得以恢复。然而,在脑缺血后第28天,Vehicle组和CH1组之间仍然没有统计学意义。2.注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）促进小鼠局灶性脑梗死慢性期白质完整性的恢复。我们通过SMI32/MBP的比值来探究CH1对小鼠局灶性脑梗死慢性期皮层和纹状体两个部位的白质完整性的影响。结果显示:与Sham组相比,Vehicle组中SMI-32/MBP比值增加（P<0.05）,即脑梗死后,梗死周围皮层及纹状体区均发生了严重的脑白质纤维损伤。与Vehicle组相比,CH1组显著降低了 CTX和STR区中SMI32/MBP的值,表明CH1在远期改善了白质的完整性。3.注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）增强了局灶性脑缺血后小鼠的轴突可塑性我们通过BDA染色来标记缺血半暗带区及从缺血对侧发出的轴突出芽情况,结果显示:小鼠局灶性脑缺血后28天,缺血半暗带区中BDA阳性神经元的面积和从对侧发出的跨中线交叉的轴突的数量显著增加。与Vehicle组相比,CH1又进一步增加了缺血半暗带区的BDA阳性面积和跨中线交叉的轴突的数量,结果具有统计学意义（P<0.05）。同时,CH1在dMCAO术后第28天上调了 GAP43的蛋白表达水平。结论:1.注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）促进局灶性脑缺血后慢性期白质完整性的恢复,而对灰质完整性无影响。提示注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）通过改善白质完整性促进脑梗死后神经功能恢复。2.小鼠局灶性脑缺血后启动内源性轴突再生,注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）可以进一步促进慢性期轴突再生,促进脑梗死后神经功能的恢复。第三部分 注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）通过Shh/Ptch/Gli-1通路促进白质修复目的:为了探索CH1的作用机制,我们检测了 CH1对实验性脑梗死小鼠缺血半暗带区Shh通路蛋白表达及Gli-1的核转位情况的影响。观察Shh通路是否参与CH1对局灶性脑缺血小鼠的神经保护作用。并且,我们选择CYC作为Shh通路的抑制剂,旨在抑制shh通路后观察CH1的脑保护作用是否仍然存在。方法:采用随机的方法将C57BL/6小鼠分为3组:sham组:小鼠假手术后腹腔注射等量的生理盐水;Vehicle组:小鼠大脑中动脉远端闭塞后腹腔注射等量的生理盐水;注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）中剂量组（CH1组）:小鼠大脑中动脉远端闭塞后腹腔注射等量的10mg/kg CH1。注射用脑蛋白水解物（Ⅰ）中剂量+CYC组（CH1+CYC组）:小鼠大脑中动脉远端闭塞后腹腔注射等量的10 mg/kg CH1+CYC（1 mg/ml,10 mg/kg）治疗小鼠;每天由腹腔注射,局灶性脑缺血后14天连续注射。通过western bolt检测局灶性脑梗死后28天shh通路蛋白Shh、Ptch-1、Smo、Gli-1的表达水平,通过免疫荧光检测Gli-1的核转位情况。加入Shh通路抑制剂CYC,通过行为学检测CH1神经系统改善是否还有作用。结果:1.CH1通过激活shh/Ptch-1/Gli-1信号通路促进轴突再生。我们通过western blot检测了 shh信号通路蛋白的表达水平,结果显示:shh信号通路在局灶性脑缺血后被激活。与Vehicle组相比,CH1治疗在局灶性脑缺血后28 d时显著增加了 shh,Ptch-1和Gli-1的相对表达。我们通过免疫荧光分析检测了 Gli-1在细胞内的分布情况。结果显示:在dMCAO之后28天,Gli-1从细胞质转位到了细胞核。与Vehicle组相比,CH1组的细胞核中积累了更多的Gli-1。2.抑制shh通路的逆转CH1引起的神经功能改善。我们加入了 Shh信号通路抑制剂环巴胺（CYC）来研究Shh信号通路在CH1诱导的神经系统改善中的作用。结果显示:与CH1组相比,CYC显著降低了 Gli-1和Ptch-1的表达,但没有降低shh,表明CYC在CH1存在时可以有效地阻断Shh信号传导。与CH1组相比,CH1+CYC组的rotarod实验的转棒时间显著减少,在贴纸去除试验和mNSS试验中也观察到了 CYC的阻断CH1的作用。然后,应用CYC后通过Western bolt检测了 GAP43的表达,结果表明:CH1对GAP43表达的增高作用受到了抑制。结论:1.本实验证明局灶性脑缺血后远期缺血半暗带区的Shh通路被激活,CH1可以进一步激活shh通路。2.Shh通路的抑制剂CYC会逆转CH1的对局灶性脑缺血小鼠神经功能的保护作用,说明局灶性脑缺血后CH1的神经保护作用至少部分通过shh通路起作用。