研究背景与目的胃癌(gastric cancer)是常见的消化道恶性肿瘤之一,以腺癌居多,其发生率占胃恶性肿瘤的95%,复发和转移是病人死亡的主要原因。上皮-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是目前肿瘤研究中的热点,它是指上皮源性肿瘤细胞从上皮表型向间叶源性表型转变,获得间叶源性细胞特性的过程。是肿瘤细胞运动能力、侵袭转移潜能增强的重要信号。巢蛋白(Nestin)是一个含有1621个氨基酸的第VI类中间丝大分子蛋白,可在细胞浆和细胞核中表达。近年来的研究表明,nestin作为干细胞标志物在脑肿瘤、肝癌、骨肉瘤、胰腺癌、横纹肌肉瘤、黑色素瘤、肺癌、子宫内膜癌、头颈部肿瘤、前列腺癌等均有不同程度的表达,并且发现nestin在肿瘤中的表达大多数与肿瘤的恶性程度成正比,常常提示预后不良。项鹏等采用免疫定量组织化学法对临床肿瘤病理标本进行分析发现,不同肿瘤中nestin的表达情况不尽相同,如:nestin在高恶性程度的胃肠道间质瘤(GIST)中的表达指数为2.2366,在低恶性度的GIST中却是1.3783。在一些良性肿瘤中如海绵状血管瘤中则不表达。并且在该研究中作者还发现nestin在低分化血管肉瘤及低分化GIST中出现有核表达现象,在后续对nestin的研究中,Loja T和Krupkova 0 J也分别在脑肿瘤细胞中发现有nestin核定位情况,认为nestin入核可能对细胞染色质重塑或调控下游基因起作用,但具体功能机制尚不明确。同时,KleebergeW等采用前列腺肿瘤病人的组织标本和转移性前列腺癌的细胞株PC3、Lncap对nestin在前列腺癌中的作用进行了研究,发现nestin主要在转移的病理标本和细胞中表达,采用RNA干扰技术对nestin高表达的细胞进行处理后,细胞的侵袭迁移能力明显受到抑制。该结果表明nestin与前列腺癌侵袭转移密切相关。然而,人们对于nestin在胃腺癌中的功能作用却知之甚少,nestin是否与胃腺癌细胞侵袭转移有关尚未见报道。基于以上背景,本课题的研究主要从以下三部分进行展开,(1)第一部分:收集125例胃腺癌及60例相应癌旁石蜡组织标本,制备连续切片,检测nestin该项指标在125例癌及60例癌旁石蜡组织标本中的表达及定位情况。结合病人临床资料,统计学分析nestin不同表达量和亚细胞定位所代表的临床意义,并比较nestin不同亚细胞定位的预后差异。(2)第二部分:在胃腺癌石蜡组织连续切片中检测EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin、Snail)在125例癌及60例癌旁组织标本中的表达情况,并结合第一部分nestin的检测结果,分析nestin与EMT相关蛋白的关系,并进行预后评估。(3)第三部分:通过RNA干扰技术,瞬时干扰nestin在胃腺癌细胞中的表达,观察并检测nestin干扰组与对照组中细胞迁移、侵袭能力的改变,及对EMT相关蛋白表达的影响,验证nestin及EMT相关蛋白在组织中的检测结果。第一部分Nestin在胃腺癌组织中的表达及其临床意义研究内容与方法(1)收集胃腺癌石蜡组织标本共计125例;相应的癌旁石蜡组织标本(自癌灶边缘5cm以外取材,经病理切片证实无癌细胞浸润)作为正常对照,共计60例。连续切片,厚度为3 μm。(2)通过免疫组织化学方法检测nestin蛋白在125例胃腺癌组织切片及60例癌旁正常组织切片中的表达情况,分析其表达及不同亚细胞定位与临床病理特征和患者预后之间的关系。结果Nestin在胃腺癌组织中具有3种不同表达形式,分别是单纯浆表达、单纯核表达及浆核共表达;肿瘤组nestin阳性率明显高于癌旁对照组,两组间差异具有统计学意义(P=0.001)。nestin胞浆阳性(单纯胞浆+胞浆胞核双阳性)、胞核阳性(单纯胞核+胞浆胞核双阳性)均与胃腺癌T分期、N分期显著相关(P<0.05),而nestin胞核阳性还表现为与肿瘤分化程度密切相关(P= 0.017),胞核阳性组集中在分化程度较低的一方。nestin阳性组生存时间较阴性组生存时间明显缩短(P=0.013)。相比较nestin单纯浆阳性、单纯核阳性组,nestin胞浆胞核双阳性组患者呈现出较差的预后趋势。多因素Cox回归分析表明只有N分期可作为影响胃腺癌预后的独立指标,N2-N3期患者的死亡风险是NO-N1期患者的4.096倍。结论1.Nestin参与胃腺癌的发生发展,nestin阳性提示患者生存时间明显缩短。2.Nestin核定位(包括单纯核表达和浆核共表达)可能提示胃腺癌高度恶性。3.Nestin浆核共表达可能代表着较差的预后。第二部分Nestin与EMT相关蛋白在胃腺癌中表达的相关性及临床意义研究内容与方法(1)免疫组织化学方法检测EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、Snail在125例胃腺癌组织切片及60例癌旁正常组织切片中的表达情况,分析其不同表达量与临床病理特征的关系。(2)统计学分析nestin蛋白与EMT相关蛋白的相关性及对患者的预后评估。结果1.Nestin在胃腺癌及癌旁中的表达及其预后评估详见第一部分。2.E-cadherin在癌旁组织中主要定位于胞膜,阳性率为90.0%(54/60);在癌组织中不表达或表达下降,阳性率为53.6%(67/125),肿瘤组与癌旁对照组差异明显(X2=23.739,P=0.000)。E-cadherin阳性表达者生存时间较阴性表达者明显延长(P=0.017)。3.Vimentin在癌旁正常胃黏膜上皮组织中主要在上皮细胞间质和炎症细胞中表达,而在上皮细胞中不表达,阳性率为0;在胃腺癌组织中,我们发现Vimentin表达位于细胞浆,阳性率为12.8%(16/125)。两组间比较差异具有统计学意义(X2= 8.407;P=0.004)。Vimentin阳性表达患者较阴性表达患者呈现出较差的预后趋势(P= 0.077)。4.Snail蛋白在癌旁正常胃黏膜上皮组织中表达缺失或不表达,阳性率仅有3.3%(2/60);而在胃腺癌组织中表达显著升高,两组间差异具有统计学意义(X2= 9.629;P=0.002)。Snail表达于肿瘤细胞胞浆和胞核,阳性率为20.8%(26/125),在一些肿瘤组织侵袭边缘,Snail阳性表达也是比较常见。单因素生存分析显示Snail阳性患者较阴性患者生存时间显著缩短(P=0.001)。5.Spearman关联性分析证实nestin阳性表达与E-cadherin呈负相关(r=-0.280;P=0.002),与 Vimentin(r =0.482;P= 0.000).Snail(r =0.451;P=0.000)呈正相关。有趣的是,nestin单纯浆表达与Vimenin、Snail 显著相关(P<0.05),而与 E-cadhein 表达不相关(P>0.05);nestin单纯核表达与E-cadherin、Snail明显相关(P<0.05),而与Vimentin表达不相关(P>0.05);然而,nestin浆核共表达既与E-cadherin呈负相关(r=-0.192;P0.032),也与 Vimentin(r=0.427;P=0.000)、Snail(r= 0.212;P=0.018)呈正相关。生存分析显示,nestin浆核共表达较nestin单纯浆或单纯核表达呈现出较差的预后趋势,其5年生存率(0)明显低于单纯浆定位(28.6%)和单纯核定位(300%)的5年生存率。6.将肿瘤大小、分化程度、T分期、N分期、pTNM分期、Nestin、E-cadherin、Snail该8项单因素分析有统计学差异的病理参数及检测指标进行多因素Cox回归分析,最后得出有统计学差异的影响因素只有N分期(P=0.003),N2-N3期患者的死亡风险是NO-N1期患者的3.559倍。结论1.Nestin参与胃腺癌恶性转变,可能在胃腺癌细胞发生EMT过程中发挥重要作用。2.Nestin核定位(包括nestin单纯核表达和nestin漿核共表达)与E-cadherin下调密切相关,nsestin入核可能参与调控E-cadherin的表达。3.Nestin,特别是nestin浆核共表达的定位模式,将为临床诊断及靶向治疗胃腺癌提供可能的实验基础和理论依据。第三部分s iRNA干扰nest in对胃腺癌细胞上皮间充质转化以及体外侵袭迁移能力的影响研究内容与方法(1)Nestin在胃腺癌细胞株中的表达水平检测1)采用Q-PCR、免疫细胞化学(ICC)、Western blot检测nestin在正常胃上皮细胞GES-1和4株胃腺癌细胞MKN28、AGS、SGC7901、MGC803中的表达情况,同时筛选出nestin相对较高表达的2株胃腺癌细胞进行后续实验。2)针对人nestin序列,由锐博生物公司设计并合成3对siRNA干扰序列,分别瞬时转染nestin高表达的胃腺癌细胞株细胞,干扰60小时后,常规提取被干扰的胃腺癌细胞蛋白,采用Western blot的方法筛选出干扰效果最佳的siRNA片段进行后续实验。(2)干扰nestin对胃腺癌细胞侵袭迁移及EMT相关蛋白表达的影响siRNA干扰nestin后,分别进行细胞划痕、Transwell体外迁移实验及Boyden体外侵袭实验。同时利用Western blot检测,干扰nestin后EMT 相关蛋白(E-cadherin、Vimentin、Snail)的改变。结果1.Q-PCR、免疫细胞化学(ICC)、Western blot检测证实了 nestin在胃腺癌细胞中表达量明显高于正常胃上皮细胞Ges-1。结合三者实验结果及细胞生长状态,最终选定nestin表达相对较高的两株细胞:MKN28和AGS细胞。2.严格按照riboFECTMCP转染试剂使用说明书瞬转MKN28和AGS后,经western blot证实siRNA-002为最佳干扰片段,将用于后续实验。3.划痕实验及Transwell体外迁移实验显示,干扰nestin后,MKN28及AGS迁移能力减弱(P<0.001);Boyden体外侵袭实验结果显示,下调nestin的表达后,MKN28和AGS的穿膜细胞数减少(P<0.001)。表明细胞迁移侵袭能力减弱。4.Western blot检测结果表明,干扰nestin后,E-cadherin表达上调,而Vimentin、Snail表达下调,提示nestin可能参与诱导胃腺癌细胞发生EMT。结论抑制nestin表达可抑制胃腺癌细胞发生侵袭迁移,同时抑制胃腺癌细胞EMT相关蛋白的表达。