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脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤,约占颅内肿瘤的46%。恶性胶质瘤的发病率为5-8/100,000,世界卫生组织1998年公布按死亡率顺序排位,恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因,是35~54岁患者的第4位死亡原因。由于胶质瘤的侵袭性生长,手术难以完全切除;化疗和放疗既不能高度特异性地杀伤胶质瘤细胞,治疗效果差,又可能产生中枢神经系统的毒、副作用。上述情况在近30年的临床实践中未得到根本改善,因此脑胶质瘤仍是神经外科领域的难治性疾病,阐明发病机理、寻找新的治疗手段的仍然是神经外科的热点课题。目前分子病理学认为胶质瘤本质上是一种多基因异常疾病,通过一种/多种癌基因的过表达、同时伴随抑癌基因的突变缺失从而使信号传导通路异常,肿瘤细胞逃避了正常生长调控机制,自主进行增殖和侵袭、出现恶性表型。近年来研究发现,微小RNA(microRNA或miRNA)为长度约21~25核苷酸的小型非编码RNA,这些miRNA通过与靶mRNA的3`非编码区结合,可在转录后水平通过促进靶mRNA降解和/或抑制其翻译而发挥负调控基因表达的作用。已有研究证明超过50%的miRs定位在癌相关基因区域或在脆弱区域,尤其是发现有些miRs在肿瘤细胞与相应正常细胞中的表达截然不同,这使人们有理由相信miRs与肿瘤生成有关。同样,在研究胶质瘤miRs表达谱时发现一些miRs表达与正常星形细胞不同,其中miR-221和miR-222的表达明显高于正常星形细胞。miR-221和miR-222是通过调控哪些靶基因的表达来促进胶质瘤的生成,敲低胶质瘤miR-221和miR-222表达是否可以逆转胶质瘤的恶性表型,从而成为胶质瘤新的治疗靶点,这些都是值得关注的重要课题。为此,本研究将着重探索miR221和miR222在胶质瘤恶性表型中所起的作用,通过体内外研究来证实敲低胶质瘤miR-221和miR-222表达对胶质瘤生长的抑制作用。通过鉴定miR221和miR222的靶基因来探讨敲低胶质瘤miR-221和miR-222表达对胶质瘤抑制作用的机制。通过联合放射治疗来探讨敲低胶质瘤miR-221和miR-222与放疗是否具有抑制胶质瘤生长的协同作用。本研究分为五个部分进行:1.分析胶质瘤中miRNA表达数据,并通过人工合成2’-O-methyl(OMe)修饰的反义寡核苷酸(As-miR-221和As-miR-222)敲低胶质母细胞瘤细胞系U251细胞中miR-221和miR-222的表达来系统分析miR-221和miR-222对胶质母细胞瘤发生、进展所起的作用。2用脂质体介导转染As-miR-221/222于胶质母细胞瘤细胞系U251,敲低miR-221和miR-222表达,观察胶质瘤细胞增殖活性、细胞周期、侵袭能力及细胞凋亡等生物学性状的变化。3通过生物信息学的方法获得miR-221和miR-222的潜在靶基因,并通过荧光素酶报告载体策略进行鉴定,初步探讨敲低胶质瘤miR-221和miR-222表达抑制胶质瘤生长的作用机制。4构建U251裸鼠皮下荷瘤模型,进行反义miRNA221/222的体内治疗,观察肿瘤生长速度与体积,将肿瘤组织进行免疫组化染色和原位杂交分析,进一步验证反义miRNA221/222治疗后肿瘤靶基因的表达变化以及与细胞增殖,细胞周期,侵袭及凋亡的关系。5通过平板克隆形成实验证实敲低胶质瘤细胞系U251细胞的miR-221和miR-222表达对放射治疗是否具有增敏效果。通过本实验,可以得出以下几个结论:1.胶质瘤中存在一系列miRNA表达异常,miR-221和miR-222是其中表达上调的成簇miRs,miR-221过表达可以被认为是人脑胶质瘤新的分子标签。2.p27kip1、PUMA、PTEN、TIMP3、Cx43基因mRNA的3’UTR是miR-221和miR-222直接作用靶点。3.Lipofectamine 2000介导转染2’-O-methyl(OMe)修饰的反义寡核苷酸-As-miR-221/222可有效敲低miR-221和miR-222在U251人胶质母细胞瘤细胞系的表达,同时上调靶基因的表达,从而其恶性表型得以逆转,包括细胞的增殖和侵袭能力受到抑制,出现G0/G1期阻滞,并诱导细胞凋亡。4.裸鼠皮下胶质瘤模型应用Lipofectamine 2000介导的As-miR-221/222治疗,同样可有效敲低miR-221和miR-222的表达,增加靶基因的表达(p27kip1、PUMA、PTEN、TIMP3、Cx43),从而抑制肿瘤的生长,诱导细胞凋亡,与体外试验结果一致。5.敲低胶质瘤细胞系U251细胞的miR-221和miR-222后对其放射治疗有明显的增敏效果。6.miR-221和miR-222种子序列相同,为了达到最佳治疗效果,我们在敲低种子序列相同的miRs簇时,必须同时抑制两者的表达。