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γ-氨基丁酸(γ-Amino Butyric Acid,GABA)是一种天然存在于某些生物体内的非蛋白质氨基酸。具有降血压、抗焦虑、治疗癫痫病、镇静安神、控制哮喘、调节激素分泌、促进生殖和活化肝肾等多种生理功能,其制备和应用广受人们的关注与重视。谷氨酸脱羧酶(Glutamic Acid Decarboxylase,GAD;EC4.1.1.15)催化L-谷氨酸的α位脱羧反应,生成γ-氨基丁酸,是生物催化谷氨酸脱羧生成GABA的限速酶,GAD是调控GABA产量的关键基因。本研究以实验室筛选获得的1株高产GABA酵母菌菌株为GAD来源,利用PCR扩增技术克隆得到酵母菌全长GAD,对该基因进行了序列、同源性及功能分析,探索酵母菌GAD与其它微生物GAD的相似性;分别构建了酵母菌GAD原核/真核表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)原核表达宿主细胞和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115真核表达系统中进行诱导表达。发酵产物用SDS-PAGE检测。具体结果如下:1.生物合成γ-氨基丁酸酵母菌菌株的筛选从梨、苹果、猕猴桃等水果表面不同部位分离得到56株产生γ-氨基丁酸的酵母菌菌株,其中分离筛选到1株相对高产GABA(产量为4.727 g/L)的酵母菌菌株MJ2,经初步鉴定该菌株为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。对菌株MJ2的发酵培养基和发酵条件用单因素轮换试验和正交试验进行整体优化。结果表明菌株MJ2转化富集GABA的适宜条件为:以可溶性淀粉为碳源、牛肉膏为氮源,初始pH 5.5、培养温度31℃、摇床速度180 rpm时,发酵培养72h,发酵液中GABA的产量最高可达7.539 g/L。2.酵母GAD克隆及序列分析以MJ2酵母菌菌株为GAD来源,采用改良的液氮-CTAB法抽提酵母菌基因组DNA,根据啤酒酵母GAD序列两端区域设计一对特定引物,利用PCR扩增获一长度为1758 bp的目的片段,并将该基因命名为Scgad。在核苷酸水平上,Scgad全长DNA序列与啤酒酵母(S.cerevisiae)、假丝酵母(Candida glabrata)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)GAD的DNA序列相似性分别为98%、69%和67%。由Scgad所推导出的氨基酸序列全长为585个氨基酸(1755 bases,MW=65.897 KDa)。在氨基酸水平上,与啤酒酵母、假丝酵母和乳酸克鲁维酵母GAD的氨基酸序列相似性分别为100%、65%和62%。3.酵母GAD的原核表达将扩增获得的Scgad的核苷酸编码序列插入到原核表达载体pET30(+)中,构建了重组原核表达载体pET30gad,再通过PCR和酶切鉴定确认该重组质粒已转化到大肠杆菌(E.coli)原核表达宿主细胞BL21(DE3)中,并通过IPTG诱导表达外源重组蛋白。4.酵母GAD的真核表达将扩增获得的Scgad的核苷酸编码序列插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建了真核重组表达质粒pPIC9Kgad,将其整合至毕赤酵母(P.pastoris)GS115真核表达宿主细胞的染色体基因组中,并通过甲醇诱导表达外源重组蛋白,发酵液SDS-PAGE检测结果显示酵母菌GAD得到分泌表达。