植物尤其是植物种子是人类和牲畜所摄食的蛋白质的重要来源,其营养品质往往由于部分必需氨基酸的缺乏而不够完全。禾本科作物种子蛋白质通常缺乏色氨酸和赖氨酸,而在豆科植物中,甲硫氨酸(methionine,Met)为第一限制性氨基酸。获取异源高Met蛋白(methionine-rich protein,MRP)基因,通过基因工程的方法提高贫硫植物尤其是豆科作物的Met含量具有重要意义。本研究通过同源克隆技术,从禾本科不同植物中克隆到MRP基因及芦苇MRP基因5’端启动子区,通过生物信息学分析,确定该MRP基因为贮藏蛋白基因;进一步将芦苇MRP基因转化大豆,并对转化再生大豆植株进行分子生物学检测和氨基酸含量分析。本文主要研究结果如下:1.从禾本科水稻、野生稻、芦苇、稗等不同亚科和属中分别克隆到一条长度为400-450 bp,高度同源的MRP基因,其编码的多肽序列中甲硫氨酸的含量均在10%以上,远远超过豆科等贫硫植物中甲硫氨酸的含量,也大大超过了WHO所规定的食物中甲硫氨酸的平均含量。2.多重序列比对及在线Blast比对结果显示本研究中克隆的MRP基因序列与其他高甲硫氨酸贮藏蛋白基因序列存在较高同源性,极有可能是种子贮藏蛋白基因序列。3.对该基因编码的氨基酸序列进行蛋白质二级结构、motif、3-D结构及贮藏蛋白特征性结构域的模拟,发现本文中克隆的基因编码的蛋白质也含有2S清蛋白、致敏结构域、转脂蛋白和蛋白酶/淀粉酶抑制剂等几种贮藏蛋白的特征性结构域,并且通过蛋白互作模拟发现可能与高粱、水稻和玉米等10 kD醇溶蛋白结构极为相似,这也说明本文中克隆的MRP基因序列应为贮藏蛋白基因序列。4.为了进一步确认上述MRP基因就是贮藏蛋白基因,本研究根据芦苇MRP基因编码区序列设计引物,用染色体步移的方法成功地从芦苇中克隆到该基因的5′端启动子区序列。对该序列的分析表明,本文克隆的芦苇MRP基因5′端启动子区不仅具有典型的Kozak(ACACC ATG)、起始子(CAT)、TATA盒(TATAAA)、CAAT盒(CCAAAT)和GC盒(GGCGGC)等启动子特征性元件,还有高度保守的种子特异性表达的顺式作用元件,如RY repeats、GCN4盒、Prolamin盒、E盒、ABRE盒、Skn-1基序、P盒、O2-site和GARE等。这说明本文克隆芦苇高甲硫氨酸蛋白基因即为种子中特异表达的贮藏蛋白基因。启动子区的多重序列比对的结果也为证明该序列为贮藏蛋白基因序列提供了重要佐证。对信号肽序列的比对结果表明,分子量相等的MRP信号肽序列近乎一致,这可能与种子形成过程中胚乳贮藏蛋白的合成及分泌途径有关。5.本文将芦苇MRP基因编码区与双元载体pBI121构建重组质粒pBI121-LW,然后通过液氮冷激法转化农杆菌,进而侵染大豆子叶节,经过暗培养、丛生芽诱导、发状根诱导后,进行炼苗长成新的植株。GUS组织化学染色、PCR检测、荧光定量PCR检测和抗性苗叶片氨基酸含量检测等结果显示,前期克隆的芦苇高Met贮藏蛋白基因已经顺利转入大豆抗性苗中,并得到成功表达。在不同抗性苗中,转LW-MRP基因大豆植株的甲硫氨酸含量有不同程度的提高,最高达到51.11%,甲硫氨酸含量提高的平均值达到27.81%。本研究克隆的MRP基因将进一步的丰富了富Met蛋白目的基因,也为以提高Met含量为目的的植物营养蛋白基因工程提供更多的目的基因的选择,同时也为同源克隆、批量扩增相关基因找到了一条简便易行的途径。MRP基因转化大豆的研究结果为下一步大豆品质改良的育种工作奠定了一定的基础,也为下一步开展基因工程改良贫硫植物蛋白质品质提供了理论支持。