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天然免疫是机体抵抗病原体入侵的第一道屏障,能够利用模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)识别病原体相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP)。模式识别受体可分为toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)、核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体(Nucleotide-binding oligomerization domain protein-like receptors,NLRs)和视黄酸诱导基因 Ⅰ 样受体(Retinoicacid-inducible gene Ⅰ(RIG-I)-like receptors,RLRs)等受体家族。RLR受体家族包括视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-I)、黑素瘤差异化相关基因 5(Melanoma differentiation-associated gene 5,MDA5)和实验室遗传与生理学蛋白2(Laboratory of genetics and physiology 2,LGP2)。这些家族成员在对胞内的RNA病毒识别过程中起着重要作用,并能够触发一系列抗病毒天然免疫反应。在哺乳动物中,RIG-I和MDA5能够识别不同但又有重叠的RNA病毒种类。RIG-I主要识别不同长度的、具有5’端三磷酸基团或者二磷酸基团的双链RNA病毒,或长度小于1 kb的短链人工合成病毒RNA类似物聚肌苷酸-聚胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid,poly(I:C))双链 RNA 病毒;MDA5则主要识别大于1 kb的长的、双链小核糖核酸病毒和长链poly(I:C)。然而,MDA5的配体尚未完全明确。RIG-I在鸡的基因组中是缺失的,这可能是相对于表达RIG-I基因的鸭和其他哺乳动物,鸡对某些特定的病原体更易感的原因。因此,在鸡上,MDA5对细胞质中的RNA病毒的识别及抗病毒天然免疫反应的触发显得尤为重要。但是,目前鸡MDA5基因的相关研究还较少,其表达的分子调控机制尚未明确。为此,在本研究中,我们克隆并分析MDA5全长启动子序列,研究其在病毒和非病毒物质刺激时的活性状态,进而为利用此启动子制备转基因抗病鸡种奠定基础。具体研究结果如下:1.本研究以白羽鸡基因组DNA为模板进行PCR扩增,成功克隆出长度约为2.5 kb的鸡MDA5全长启动子序列。经预测,这段启动子区域中含有多个转录因子结合位点,包括Sp1、GATA-1、TGGCA-结合蛋白、AP-1、AP-3、ER-alpha、T3R-alpha、C/EBP alpha、NF-1(-样蛋白)和NF-E4的结合位点;为了探讨鸡与其他物种在进化上的关系,本研究将此启动子和其他鸟类、鱼和哺乳动物的启动子作了进化树分析。结果显示,就MDA5启动子而言,鸡与其他鸟类的进化关系较近,与哺乳动物的进化关系较远。2.本研究构建了此启动子的报告载体质粒piggybac-MDA5-DsRed,并用此质粒对鸡DF-1细胞进行转染。经过药物筛选,本研究得到了稳定转染质粒 piggybac-MDA5-DsRed 的细胞系,命名为 Piggybac-MDA5-DsRed 细胞系。在此细胞系中,DsRed的表达情况代表着MDA5启动子的活性。通过荧光显微镜观察和流式细胞仪分析,本研究发现:在正常生理条件下,表达DsRed的细胞非常少,几乎为零,表明MDA5启动子的活性极低;然而,当细胞受到长链poly(I:C)(>1 kb)和短链poly(I:C)(<1 kb)、干扰素-β(Interferon β,IFN-β)和鸡传染性法氏囊病毒的刺激(Infectious bursal disease virus,IBDV)时,表达DsRed的细胞数量显著上升,分别达到了 18%和18.0%、9.86%、2.01%和1.01%,说明MDA5启动子的活性被极大地激活了。实时定量PCR结果显示,细胞在受到poly(I:C)、IFN-β和IBDV的刺激时,DsRed的mRNA水平均得到显著的提高,与内源性MDA5和IFN-β的mRNA水平变化趋势是一致的。由于DsRed的mRNA水平代表MDA5启动子的活性,故本研究中的启动子活性与内源性MDA5的表达水平是一致的,启动子活性可以反应内源性MDA5的表达情况。此外,本研究的结果显示,相对于短链poly(I:C),长链poly(I:C)刺激能诱导更多细胞表达DsRed,引起更大的mRNA水平变化,说明相对于短链poly(I:C),鸡MDA5能够更好地识别长链poly(I:C)。同时,长链poly(I:C)的刺激不仅能够促进细胞内IFN-β表达,还能够促进细胞内IFN-α表达,而短链poly(I:C)刺激未能引起IFN-α表达量的变化,故推测长链poly(I:C)和短链poly(I:C)引导的下游信号通路略有差异。3.为了验证鸡MDA5启动子在鸡转基因抗病育种中的应用价值,本研究以PB转座子为背景,构建了由鸡MDA5启动子启动表达鸭RIG-I基因的重组表达载体,命名为PB-chMDA5-duRIG-I-mkate。试验证明,在正常情况下,检测不到鸭RIG-I的表达;而在病毒模拟物poly(I:C)刺激后,以此质粒为依托的鸭RIG-I能够在鸡DF-1细胞中表达。本研究首次成功克隆出了鸡MDA5启动子并对其功能进行了初步研究。本研究的结果表明,此启动子与得到的Piggybac-MDA5-DsRed细胞系可以用来检测鸡MDA5的配体,验证其能否调节内源性MDA5基因的表达。此外,由于此启动子的活性在正常生理条件下极低,但又在外源刺激物的作用下极大地提高,因此可以被用来启动表达其他抗病毒蛋白等目的蛋白,具有较好的应用价值。本研究对鸡天然免疫系统中的重要模式识别受体MDA5的启动子进行初步探索,将为针对鸡MDA5基因表达调控机制的研究提供理论依据,有利于完善人们对鸡天然免疫系统的认知。同时,本研究构建的鸭RIG-I表达载体质粒PB-chMDA5-duRIG-I-mkate,为表达RIG-I的转基因鸡的生产奠定了基础,进而为生产抗病毒转基因鸡开辟新了的道路。