南极磷虾抗氧化肽制备和纯化的研究

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南极磷虾是一种高蛋白含量的生物资源,其中的蛋白质含量为17.56%,且含有较多不饱和脂肪酸及全部的人体必需氨基酸。近年来,以不同来源的蛋白质为原料,研发功能性多肽产品成为了科研热点。本课题以南极磷虾蛋白为实验材料,通过三种抗氧化活性指标评测不同分子量多肽的抗氧化性,并对抗氧化多肽进行了分离、纯化。旨在增强磷虾中蛋白的功能性,拓展南极磷虾资源开发利用的方向。  论文以获得具有优越抗氧化活性多肽为目标,首先对南极磷虾抗氧化多肽的制备条件进行了优化,其抗氧化性以DPPH.,超氧阴离子,.OH的清除率作为衡量标准。实验表明:使用胰蛋白酶-中性蛋白酶复合酶解,时间为6h时得到多肽抗氧化活性最好,其DPPH.、超氧阴离子,.OH的清除率分别为72.7%,11.5%,84.8%。利用超滤膜将南极磷虾蛋白酶解物分级分离成分子量不同的五个组分,CPH I(>10ku)、CPH II(5ku~10ku)、CPH III(3ku~5ku)、CPH IV(0.5ku~3ku),CPH V(<0.5ku)。5~10ku的南极磷虾多肽抗氧化活性最好。其tricine-SDS-PAGE电泳谱图上显示有两个条带。  采用Sephadex G-50凝胶层析、高效液相,高速逆流等色谱技术,对所得多肽粗品进行进一步分离纯化。经葡聚糖 G-50凝胶层析后,得到4个组分,选取抗氧化活性较好的组分2进一步纯化。通过分析型HSCCC色谱对分离所用溶剂体系进行快速筛选,结果显示正丁醇:乙酸:水=4:1:5体系分离效果最佳。采用制备型HSCCC对组分2样品进行分离时,对其主机转速、循环水浴温度、加样浓度以及流动相的流速等四个参数进行了单因素优化,确定最优操作条件为:转速900r/min、温度25℃、加样浓度25mg/mL、流动相流速1.5mL/min。组分2经HSCCC分离得到七个组分,组分P2、P3含量较少,但其超氧阴离子自由基的清除率分别达到66.68%、70.98%;P5组分含量较多,其清除羟基、DPPH自由基的能力分别达到61.35%和27.43%。P2、P3和P5组分的氨基酸分析结果表明,Val、Ile、Met、Tyr、Leu、Glu、Asp、Pro和Phe等氨基酸与南极磷虾多肽的抗氧化性能有着紧密联系,以上氨基酸含量越高,其对应的抗氧化性越强。所以多肽的抗氧化活性不仅与分子量有关联,还受到多肽的氨基酸组成,氨基酸含量等因素影响。  利用胃蛋白酶-胰酶复合酶对所得多肽进行水解,来模拟其人体自然生理消化过程。纯化后的南极磷虾抗氧化肽经过胃蛋白酶和胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶酶解后,清除超氧阴离子、DPPH和羟基自由基的三种抗氧化指标都略有降低,但降低幅度在1%~2%之间,几乎不影响抗氧化多肽在人体内发挥其应有的功效。南极磷虾多肽粗品和纯化后的抗氧化多肽的模拟结果显示:多肽粗品的抗氧化活性远远不及纯化后磷虾多肽,通过对南极磷虾多肽进行分离纯化,进一步提升了南极磷虾蛋白的功能性。
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