研究一胃癌组织中PI3K/Akt信号通路蛋白的表达及其意义在全球范围内胃癌是较为常见的恶性肿瘤,胃癌的发病机制是一个较为复杂的过程,涉及细胞内信号传导通路的变化。本研究选取经病理诊断明确的、初次接受手术切除的胃癌患者,采用免疫组化方法研究胃癌组织中PI3K/Akt/m TOR信号通路上游信号PI3K、Akt蛋白的表达水平,探讨肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、分化程度等临床病理学参数与PI3K、Akt表达水平是否相关,探讨PI3K/Akt/m TOR信号通路是否可以成为治疗胃癌药物的新型靶点。目的:研究胃癌患者肿瘤组织中PI3K、Akt蛋白表达水平,探讨肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、分化程度与PI3K、Akt表达水平是否相关。方法:1、免疫组化法检测p-Akt、p-PI3K蛋白表达水平本研究共收集2013年8月-2016年5月于安徽医科大学第三附属医院胃肠外科行手术切除的胃癌组织43例,及其对应的癌旁组织43例(距肿瘤边缘≧5cm)。入选患者标准:1、术前及病理诊断明确2、术前未行放疗、化疗3、无远处转移。标本取材后立即以10%甲醛固定,采取石蜡切片,采用链霉菌抗生物素蛋白―过氧化物酶法(Streptavidin-perosidase,SP)检测肿瘤组织及癌旁组织中p-Akt、p-PI3K的表达水平。2、临床资料胃癌患者43例,其中男性27例,女性16例,年龄40-78岁,平均61.93±9.69,根据2014版国际抗癌联盟(UICC)分期,其中T1、T2期16例,T3、T4期27例;N0、N1期14例,N3、N4期29例。按组织学分级,其中高、中分化11例,低分化32例。3、统计学分析应用SPSS 18.0软件进行统计分析,计量资料用x±s表示,两组间均数比较采用t检验,计数资料的比较采用χ2检验,以P<0.05为有统计学意义。结果:1、胃癌组织中p-Akt、p-PI3K的表达情况胃癌组织中p-Akt、p-PI3K表达水平较强,而癌旁组织中p-Akt、p-PI3K表达水平较弱,或者呈阴性表达。2、胃癌、癌旁组织中p-PI3K、p-Akt表达水平胃癌组织中p-PI3K、p-Akt的阳性表达率分别为81.40%、74.42%,癌旁组织中p-PI3K、p-Akt阳性表达率分别为23.26%、20.93%。与癌旁组织相比,胃癌组织中p-PI3K、p-Akt表达水平明显高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.001)。3、胃癌组织中p-PI3K、p-Akt的表达与肿瘤大小的关系在肿瘤直径≤5cm的14例患者中,p-PI3K蛋白表达阳性率为78.57%,在肿瘤直径>5cm的29例患者中p-PI3K蛋白表达阳性率为82.76%,两者相比差异无统计学意义比较(P=1.000)。在肿瘤直径≤5cm的14例患者中,p-Akt蛋白表达阳性率为71.43%,在肿瘤直径>5cm的29例患者中,p-Akt蛋白表达阳性率为75.86%,两者相比差异无统计学意义(P=1.000)。4、胃癌组织中p-PI3K、p-Akt的表达与肿瘤浸润深度之间关系在16例胃癌分期为T1、T2的患者中p-PI3K蛋白阳性表达率为62.5%,27例胃癌分期为T3、T4的患者中,p-PI3K蛋白阳性表达率为92.59%,两者比较差异具有统计学意义(P<0.05)。分期为T1、T2的患者p-Akt蛋白阳性表达率为50%,T3、T4的患者中,p-Akt蛋白阳性表达率为88.89%,两者比较差异具有统计学意义(P<0.05)。5、胃癌组织中p-PI3K、p-Akt的表达与淋巴结转移之间的关系在14例胃癌分期为N0-N1的患者中p-PI3K蛋白阳性表达率为57.14%,29例分期为N2-N3的患者中,p-PI3K蛋白阳性表达率为93.10%,两者比较差异具有统计学意义(P<0.05)。分期为N0-N1的患者p-Akt蛋白阳性表达率为50%,在N2-N3的患者中,p-Akt蛋白阳性表达率为86.21%,两者比较差异具有统计学意义(P<0.05)。6、胃癌组织中p-PI3K、p-Akt的表达与分化程度之间的关系在11例中高分化的胃癌患者中p-PI3K蛋白表达率为54.55%,在32例低分化的胃癌患者中p-PI3K蛋白表达分别为90.63%,两者比较差异具有统计学意义(P<0.05)。在11例中高分化的胃癌患者中p-Akt蛋白阳性表达率为45.45%,在32例低分化的胃癌患者中,p-Akt蛋白阳性表达率为84.38%,两者比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1、胃癌组织中PI3K、Akt表达水平较高,与癌旁组织相比差异具有统计学意义。2、胃癌组织中PI3K、Akt表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移、肿瘤浸润程度相关,与肿瘤大小无关。研究二芒果苷抑制胃癌细胞增殖及其调节PI3K/Akt信号通路机制研究芒果苷(Mangiferin)为双苯吡酮类化合物,又可称为C-苷氧杂蒽酮。从漆树科芒果及扁桃树、龙胆科植物中均可提取出芒果苷,近期研究表明,芒果苷具有抗氧化、免疫调节等多种药理作用。目前,芒果苷在肿瘤中的作用研究较少,对胃癌的作用尚未见明确报道。本研究采用MTT、流式细胞术、TUNEL染色、Western Blot等方法,观察芒果苷体外对人胃癌细胞株的增殖抑制及诱导凋亡作用、研究芒果苷对凋亡相关蛋白表达水平的影响及其对PI3K/Akt信号通路的调节作用,为研究芒果苷在胃癌中的作用机制及作用靶点提供理论实验依据。目的:研究芒果苷抑制胃癌细胞的作用及其对PI3K/Akt信号通路的影响。方法:1、MTT法检测芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823的增殖影响将浓度为2.5~200μmol/L的芒果苷分别加入人胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823中培养24-72h后,选择OD 490nm在酶联免疫检测仪测量各孔的吸光值。绘制细胞生长曲线,以Graphpad prisms5软件计算IC50。2、MTT法检测芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823及人胃粘膜细胞株GES-1的增殖抑制作用比较将浓度为2.5~200μmol/L的芒果苷分别作用于人胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823及正常人胃粘膜细胞株GES-1,48h后终止培养,选择OD 490nm在酶联免疫检测仪测量各孔的吸光值。绘制细胞生长曲线,以Graphpad prisms5软件计算IC50。3、Annexin V-FITC/PI双染法检测芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901凋亡作用将不同浓度(5、10μmol/L)芒果苷分别作用于人胃癌细胞株SGC-7901达48h,胰酶消化收集细胞后,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。4、TUNEL法检测芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901的凋亡作用将不同浓度的芒果苷(5、10μmol/L)分别加入胃癌细胞SGC-7901培养48h后,TUNEL检测试剂盒检测凋亡细胞,使用激光共聚焦显微镜观察并拍照。5、Western Blot检测芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901凋亡相关蛋白的作用将不同浓度(5、10μmol/L)芒果苷分别作用于人胃癌细胞株SGC-7901,作用时间48h。Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达。6、Western Blot检测芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901中PI3K/Akt/m TOR信号通路的作用将不同浓度(5、10μmol/L)芒果苷分别作用于人胃癌细胞株SGC-7901,作用时间48h。Western Blot检测PI3K/Akt/m TOR信号通路蛋白的表达。7、Western Blot检测加入EGF刺激后芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901中PI3K/Akt/m TOR信号通路的作用将不同浓度(5、10μmol/L)芒果苷分别加入100 ng/ml的EGF,共同孵育于人胃癌细胞株SGC-7901中,作用时间48h。Western Blot检测PI3K/Akt/m TOR信号通路蛋白的表达。8、芒果苷联合PI3K/Akt调节剂对人胃癌细胞株SGC-7901的作用将浓度10μmol/L的PI3K抑制剂Ly294002、浓度20μmol/L的Akt激动剂SC79,分别与5μmol/L的芒果苷共同孵育于人胃癌细胞株SGC-7901中,作用时间48h。Western Blot检测芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901中PI3K/Akt/m TOR信号通路相关蛋白的作用。MTT法检测PI3K/Akt调节剂联合芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901的增殖抑制作用,TUNEL法检测PI3K/Akt调节剂联合芒果苷对人癌细胞株SGC-7901的凋亡作用。9、统计学分析应用SPSS 18.0软件进行统计分析,计量资料用x±s表示,两组间均数比较采用t检验,计数资料的比较采用χ2检验,以P<0.05为有统计学意义。结果:1、芒果苷对胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823的增殖抑制作用芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823具有增殖抑制作用,随着芒果苷处理浓度的增加,作用时间的延长,肿瘤细胞存活率逐渐降低。芒果苷对胃癌细胞株SGC-7901的半数抑制浓度明显低于对胃癌细胞株BGC-823的半数抑制浓度。2、芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823及人胃粘膜细胞株GES-1的增殖抑制作用比较芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823具有明显的增殖抑制作用,而对于正常人胃粘膜细胞株GES-1几乎没有抑制作用。3、Annexin V-FITC/PI双染法检测芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901的凋亡作用芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901具有凋亡作用,随着芒果苷作用浓度的增加,细胞凋亡率也相应增加。4、TUNEL法检测芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901的凋亡作用芒果苷作用后视野范围内出现大量凋亡细胞,凋亡细胞中染色质浓缩,细胞皱缩、变形,体积变小,可见凋亡小体。对照组中细胞排列紧密,凋亡细胞基本观察不到。随着芒果苷作用浓度的增加,细胞凋亡率也相应增加。5、Western Blot检测芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901凋亡相关蛋白的作用芒果苷能够下调人胃癌细胞株SGC-7901中Bcl-x L、Bcl-2、Mcl-1表达水平,其作用随芒果苷处理浓度增强而增加,芒果苷可增加Bad、Bax、人胃癌细胞株细胞色素C、Caspase-9、Capase-3表达水平,其作用随芒果苷浓度增加而增强。6、Western Blot检测芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901中PI3K/Akt/m TOR信号通路的作用芒果苷能够下调人胃癌细胞株SGC-7901 PI3K/Akt/m TOR信号通路中磷酸化PI3K、磷酸化Akt、磷酸化m TOR的表达水平,其作用随芒果苷处理浓度增加而增强。7、Western Blot检测加入EGF刺激后芒果苷对人胃癌细胞株SGC-7901中PI3K/Akt/m TOR信号通路的作用EGF能够增强人胃癌细胞株PI3K/Akt/m TOR信号通路中磷酸化PI3K、磷酸化Akt的表达水平,在加入EGF刺激后,芒果苷仍然能够下调人胃癌细胞株PI3K/Akt/m TOR信号通路中磷酸化PI3K、磷酸化Akt的表达水平,其作用随芒果苷浓度的增加而增强。8、芒果苷联合PI3K/Akt调节剂对人胃癌细胞株SGC-7901的作用PI3K抑制剂Ly294002能够抑制人胃癌细胞株PI3K/Akt/m TOR信号通路中磷酸化PI3K的表达水平,Akt激动剂SC79能够上调PI3K/Akt/m TOR信号通路中磷酸化Akt的表达水平,Ly294002联合芒果苷能够抑制人胃癌细胞株PI3K/Akt/m TOR信号通路中磷酸化PI3K的表达水平。SC79与芒果苷作用于人胃癌细胞株SGC-7901时,芒果苷对PI3K/Akt/m TOR信号通路中磷酸化Akt的下调水平可被SC79拮抗。Ly294002联合芒果苷能够显著降低芒果苷的半数抑制浓度。SC79与芒果苷作用于人胃癌细胞株SGC-7901时,芒果苷的半数抑制浓度被增加。Ly294002联合芒果苷能够增强芒果苷的诱导凋亡作用,SC79与芒果苷联合能够降低芒果苷的诱导凋亡作用。结论:1、芒果苷体外对人胃癌细胞株SGC-7901具有较强的抑制作用。2、芒果苷体外对人胃癌细胞株SGC-7901具有诱导凋亡作用,同时芒果苷能够介导凋亡相关蛋白的调控。3、芒果苷体外对人胃癌细胞株SGC-7901具有诱导凋亡作用及抑制肿瘤细胞增殖作用,可能与其调节PI3K/Akt信号通路相关。