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血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)和血睾屏障(blood-testis barrier，BTB)是哺乳动物中的两个最紧密的血液-组织屏障，它们只允许小分子(分子量<600)和脂溶性药物通过，而且在该屏障上还存在阻止药物运输的药物转运蛋白，如P-糖蛋白，所以在治疗阿尔茨海默病，帕金森氏病，睾丸癌和病毒感染等相关疾病时，这些紧密屏障对治疗药物的递送构成了主要障碍。研究表明，综合药物化学数据库中的7000个药物中，仅有1%药物可透过血脑屏障在中枢神经系统中发挥作用。因此，在中枢性神经疾病高发的当下，构建高效安全的跨BBB药物递送模型，提高中枢神经系统疾病的药物治疗效果是亟待解决的问题。与BBB相比，本实验室在BTB研究方面有多年的经验累积和丰富的科研成果，能够为跨BBB的药物递送提供参考与借鉴。本文试图构建一个跨越BTB递送药物(Adjudin，一种正在研究的非激素男性避孕药，它也具有抗癌，抗神经炎症和抗耳毒性的作用)的模型，并从微管调节蛋白方面阐述其潜在的分子调节机制，主要研究内容如下：
(1)前期研究表明，睾丸中存在一个顶端外质特化-血睾屏障-基底膜(apical ES-BTB-BM)的局部功能轴，其中包含影响BTB功能和精子发生的两种调节分子，即F5-肽和rpS6(rpS6为mTORC1下游的信号蛋白)。在该研究中，将F5-肽和p-rpS6-MT(rpS6的四重磷酸化突变体)在SD大鼠睾丸内进行单独或者双重过表达，或与10mg/kgAdjudin联用。BTB完整性测定结果表明，F5-肽和rpS6-MT的联合过表达损伤BTB的完整性，在此基础上，10mg/kgAdjudin可使BTB的结构几乎完全解体，失去BTB特有的屏障功能。HE结果显示，10mg/kgAdjudin在F5-肽和rpS6-MT的辅助下，使生殖细胞从生精上皮中几乎完全脱落，生精小管中无精子细胞，支持细胞(Sertolicell，Sertoli细胞)也几乎消失殆尽，这相当于50mg/kg或者100mg/kgAdjudin的药物作用效果。因此，通过这两个分子在睾丸内的过表达，可促进Adjudin跨越BTB进入睾丸的生精小管发挥作用。这些发现有望改善跨BTB向睾丸递送药物效率，同时也适用于其他跨血液-组织屏障的药物递送，通过使用内源性产生的屏障修饰分子，改变紧密连接(tight junction，TJ)-渗透屏障，从而实现将药物递送到血液-组织屏障之后的靶器官。由于BTB的结构是以细胞骨架蛋白为基础的，那么该药物递送模型是通过F5-肽和p-rpS6-MT下游的信号传导影响细胞骨架蛋白，从而使BTB发生“渗漏”，还是通过其他的分子机制发挥作用，这有待于进一步研究。
(2)在向睾丸内递送Adjudin模型中，原本对成年大鼠的精子发生无影响的10mg/kgAdjudin，在rpS6-MT和F5-肽的协同作用下，能够有效诱导生殖细胞剥脱从而发挥抗生育作用，通过IF，IB，和Co-IP等技术，探究了该模型的体内分子调节机制。研究结果表明，这种效应是由生精上皮中微管变化介导的，其中微管在生精上皮中辐射状轨道结构被严重破坏，如大量微管被截短，甚至崩塌，因此精子细胞和细胞器的转运未能顺利进行，精子发生过程严重受阻。进一步的研究表明，微管调节蛋白CAMSAP2(-TIP)，EB1(+TIP)和MARK4空间表达受抑制，Co-IP结果显示，CAMSAP2，EB1和MARK4与微管相关联的能力大大降低。与微管正端结合的EB1主要促进微管生长，稳定微管使其免于遭受崩塌，而MARK4是微管亲和力调节激酶，可磷酸化微管相关蛋白，使其从微管分离，引起微管崩塌。但是尚未有关于CAMSAP2在睾丸Sertoli细胞中作用的研究，CAMSAP2在这个向睾丸递送Adjudin模型中的作用尚不清楚。
(3)上述实验探讨了在p-rpS6-MT和F5-肽的辅助下，Adjudin对BTB与精子发生的影响，其中涉及多个细胞骨架蛋白分子，如CAMSAP2、EB1和MARK4。由于EB1和MARK4在BTB功能维持中的作用已经明确，因此本部分将着重从CAMSAP2角度研究这三者的共同作用。该部分的实验采用原代Sertoli细胞的体外培养体系，通过siRNA技术KD(敲低)Sertoli细胞中camsap2基因，探索CAMSAP2在BTB构成和精子发生中的作用。研究结果表明，Sertoli细胞中CAMSAP2KD可促进微管负端增长，从而促进Sertoli细胞的TJ-渗透性屏障功能的维持。为了进一步证实CAMSAP2KD促进Sertoli细胞的TJ-屏障功能，该实验使用PFOS诱导的Sertoli细胞损伤模型进行更深入的探究。研究显示，CAMSAP2KD通过纠正PFOS引起的胞质中微管和肌动蛋白结构破损，微管聚合(及其动力学)和肌动蛋白成束活性(及聚合动力学)，从而恢复PFOS介导的TJ-屏障功能损伤。CO-IP结果显示，CAMSAP2KD之后，MARK4的激活，导致EB1蛋白水平的增加，使得Sertoli细胞中游离微管得以聚合成束，形成微管微丝，从而增强Sertoli细胞的TJ-屏障。
总之，通过这三个部分的实验，本研究建立了将药物跨BTB向睾丸递送药物(Adjudin)的模型，并探索了其潜在的微管蛋白及其调节蛋白方面的机制。EB1正向调节微管的结构与功能，CAMSAP2与MARK4起负向调节作用，三者共同作用于微管，改变微管的动力学与功能，从而影响BTB的构成和完整性，最终促进Adjudin(10mg/kg.bw.)跨越BTB发挥作用。
(1)前期研究表明，睾丸中存在一个顶端外质特化-血睾屏障-基底膜(apical ES-BTB-BM)的局部功能轴，其中包含影响BTB功能和精子发生的两种调节分子，即F5-肽和rpS6(rpS6为mTORC1下游的信号蛋白)。在该研究中，将F5-肽和p-rpS6-MT(rpS6的四重磷酸化突变体)在SD大鼠睾丸内进行单独或者双重过表达，或与10mg/kgAdjudin联用。BTB完整性测定结果表明，F5-肽和rpS6-MT的联合过表达损伤BTB的完整性，在此基础上，10mg/kgAdjudin可使BTB的结构几乎完全解体，失去BTB特有的屏障功能。HE结果显示，10mg/kgAdjudin在F5-肽和rpS6-MT的辅助下，使生殖细胞从生精上皮中几乎完全脱落，生精小管中无精子细胞，支持细胞(Sertolicell，Sertoli细胞)也几乎消失殆尽，这相当于50mg/kg或者100mg/kgAdjudin的药物作用效果。因此，通过这两个分子在睾丸内的过表达，可促进Adjudin跨越BTB进入睾丸的生精小管发挥作用。这些发现有望改善跨BTB向睾丸递送药物效率，同时也适用于其他跨血液-组织屏障的药物递送，通过使用内源性产生的屏障修饰分子，改变紧密连接(tight junction，TJ)-渗透屏障，从而实现将药物递送到血液-组织屏障之后的靶器官。由于BTB的结构是以细胞骨架蛋白为基础的，那么该药物递送模型是通过F5-肽和p-rpS6-MT下游的信号传导影响细胞骨架蛋白，从而使BTB发生“渗漏”，还是通过其他的分子机制发挥作用，这有待于进一步研究。
(2)在向睾丸内递送Adjudin模型中，原本对成年大鼠的精子发生无影响的10mg/kgAdjudin，在rpS6-MT和F5-肽的协同作用下，能够有效诱导生殖细胞剥脱从而发挥抗生育作用，通过IF，IB，和Co-IP等技术，探究了该模型的体内分子调节机制。研究结果表明，这种效应是由生精上皮中微管变化介导的，其中微管在生精上皮中辐射状轨道结构被严重破坏，如大量微管被截短，甚至崩塌，因此精子细胞和细胞器的转运未能顺利进行，精子发生过程严重受阻。进一步的研究表明，微管调节蛋白CAMSAP2(-TIP)，EB1(+TIP)和MARK4空间表达受抑制，Co-IP结果显示，CAMSAP2，EB1和MARK4与微管相关联的能力大大降低。与微管正端结合的EB1主要促进微管生长，稳定微管使其免于遭受崩塌，而MARK4是微管亲和力调节激酶，可磷酸化微管相关蛋白，使其从微管分离，引起微管崩塌。但是尚未有关于CAMSAP2在睾丸Sertoli细胞中作用的研究，CAMSAP2在这个向睾丸递送Adjudin模型中的作用尚不清楚。
(3)上述实验探讨了在p-rpS6-MT和F5-肽的辅助下，Adjudin对BTB与精子发生的影响，其中涉及多个细胞骨架蛋白分子，如CAMSAP2、EB1和MARK4。由于EB1和MARK4在BTB功能维持中的作用已经明确，因此本部分将着重从CAMSAP2角度研究这三者的共同作用。该部分的实验采用原代Sertoli细胞的体外培养体系，通过siRNA技术KD(敲低)Sertoli细胞中camsap2基因，探索CAMSAP2在BTB构成和精子发生中的作用。研究结果表明，Sertoli细胞中CAMSAP2KD可促进微管负端增长，从而促进Sertoli细胞的TJ-渗透性屏障功能的维持。为了进一步证实CAMSAP2KD促进Sertoli细胞的TJ-屏障功能，该实验使用PFOS诱导的Sertoli细胞损伤模型进行更深入的探究。研究显示，CAMSAP2KD通过纠正PFOS引起的胞质中微管和肌动蛋白结构破损，微管聚合(及其动力学)和肌动蛋白成束活性(及聚合动力学)，从而恢复PFOS介导的TJ-屏障功能损伤。CO-IP结果显示，CAMSAP2KD之后，MARK4的激活，导致EB1蛋白水平的增加，使得Sertoli细胞中游离微管得以聚合成束，形成微管微丝，从而增强Sertoli细胞的TJ-屏障。
总之，通过这三个部分的实验，本研究建立了将药物跨BTB向睾丸递送药物(Adjudin)的模型，并探索了其潜在的微管蛋白及其调节蛋白方面的机制。EB1正向调节微管的结构与功能，CAMSAP2与MARK4起负向调节作用，三者共同作用于微管，改变微管的动力学与功能，从而影响BTB的构成和完整性，最终促进Adjudin(10mg/kg.bw.)跨越BTB发挥作用。