研究背景:随着含碘造影剂在临床诊疗过程中使用的普遍化,造影剂急性肾损伤(CIAKI,contrast-induced acute kidney injury)已成为最常见的医院获得性肾损伤之一。CIAKI是含碘造影剂在使用过程中的常见并发症,严重者可导致急性肾衰竭,病死率高,预后差。目前临床上对于CIAKI缺乏有效的诊断手段及治疗方法。CIAKI发病机制复杂,尚未完全阐明,目前多数观点集中在含碘造影剂对肾小管上皮细胞的直接损伤及肾脏髓质缺血缺氧等方面。活性氧自由基(ROS,reactive oxygen species)在CIAKI发生过程中占据重要地位,其在发病机制中的作用越来越受到重视,但ROS在该疾病过程中具体机制尚未完全阐明;含碘造影剂可通过激活一系列离子通道导致肾小管上皮细胞的直接损伤,诱发多种凋亡途径的激活进而导致肾小管上皮细胞出现凋亡。相关实验研究发现:CIAKI小鼠肾脏组织匀浆检测氧化应激相关的指标:丙二醛、黄嘌呤氧化酶活性显著升高;与此相反,抗氧化指标:超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性及数量都明显下降。目前的大量研究已经证实造影剂可通过多种途径产生大量ROS,从而导致病变组织内部氧自由基蓄积,造成局部组织的损伤。凋亡是极度保守的过程,该过程需要机体内部多种基因与生物酶的严密调控。Bcl-2家族蛋白中的Bcl-2与Bax是一对具有相反功能的蛋白质,前者具有促进细胞凋亡的作用,后者抑制细胞凋亡的进程。Caspase3是整个凋亡过程中的关键酶,它对其底物进行有限不可逆地降解,细胞凋亡的过程就是该降解过程的级联放大反应,而Bcl-2对Caspases3的调控则是通过减少细胞色素C的释放来实现的。SIRT3是生物体内一种重要的去乙酰化酶,SIRT3的去乙酰化作用在提高线粒体抗氧化应激、减轻细胞凋亡与新陈代谢等重要生物学过程中发挥重要作用。目前的多项研究已经证实,SIRT3在诸多的生物过程中作为一个关键的调节因子而存在,它常常在蛋白质合成后的修饰阶段,通过调节各种底物的去乙酰化状态而在多种疾病中发挥作用。相关的诸多实验研究已经表明,沉默调节蛋白SIRT3参与了众多的细胞生物学过程,譬如生物体各种基因的转录过程、新陈代谢以及细胞电子信号链传递等重要的细胞活动。去乙酰化酶SIRT3可以在蛋白翻译后的修饰过程中,通过调节底物的去乙酰化状态而对多种疾病过程起到调节作用。肾脏是高能量代谢的器官,肾脏细胞尤其是肾小管上皮细胞内存有数量庞大的线粒体,以满足这高能量代谢需求;线粒体广泛参与能量代谢、脂肪酸氧化、大分子生物合成、氨基酸分解、电子传递与氧化磷酸化等生物学过程,而线粒体在参与这些过程的同时,也造成了严重的氧自由基的蓄积。去乙酰化酶SIRT3定位于线粒体当中,是NAD+依赖的去乙酰化蛋白,是线粒体调节上述生物学过程的关键酶,这些过程中许多酶活性的调节,都是通过其去乙酰化的修饰来完成的。烟酰胺核糖Nicotinamide riboside(NR),是由核糖和烟酰胺两种物质组成的化合物,哺乳动物的乳汁、酵母菌以及常见的各种细菌中都有NR的存在。NR转运至细胞内后,由其激酶分解为单核苷酸,单核苷酸在其腺昔酰基转移酶降解为NAD+,提高了组织中NAD+水平,而发挥其在机体内的多种生物学活性。NAD+是SIRT3催化去乙酰化反应的重要辅助因子,NAD+水平高低直接对SIRT3的去乙酰化活性起到重要的限制作用。虽然在诸多疾病的病理进程中去乙酰化酶SIRT3发挥着不可或缺的作用,但是SIRT3在造影剂诱发的急性肾损伤中的作用以及其相关的作用机制仍不清楚。为此,本研究拟利用SIRT3-KO小鼠建立CIAKI小鼠模型后,初步探讨SIRT3在该病理过程中的作用及相关机制,为临床预防治疗CIAKI带来新的思路,为设计以SIRT3为作用靶点的新型药物提供理论支持及实验依据。研究目的:1.探讨SIRT3在造影剂急性肾损伤小鼠模型中表达的变化;2.探讨SIRT3对造影剂急性肾损伤小鼠模型氧化应激的影响;3.探讨SIRT3对造影剂急性肾损伤小鼠模型凋亡的影响。研究方法:1.实验动物及分组:129野生型小鼠(雄性,8周龄)购自北京大学实验动物研究所。SIRT3基因敲除小鼠(SIRT3-KO)购自美国Jackson实验室,其基因背景是129S6/SvEvTac。全部实验过程严格按照中华人民共和国卫生部实验动物管理规章制度(documentation No 55,2001)实施,并取得山大附属齐鲁医院伦理委员会对该动物实验研究的批准。体内实验的第一部分:随机选择129野生型小鼠和SIRT3-KO小鼠各16只,两种小鼠均随机各分为对照组、CIAKI模型组,每组8只小鼠(n=8)。体内实验的第二部分:随机选择129野生型小鼠(8周龄)和SIRT3-KO小鼠(8周龄)各16只,构建CIAKI动物模型。为评估SIRT3激活剂Nicotinamide riboside(NR)在CIAKI中的作用,在构建CIAKI模型的基础上按照是否加入NR干预分为4组,WT+碘佛醇+Saline组,SIRT3-KO+碘佛醇+Saline 组,WT+碘佛醇+NR 组,SIRT3-KO+碘佛醇+NR 组。2.构建CIAKI动物模型:小鼠尾静脉注射吲哚美辛(10ug/g);15分钟后注射Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME,10ug/g);15分钟后按2mg Iodine/g剂量尾静脉注射碘佛醇(Ioversol,350mg Iodine/ml)。对照组尾静脉注射等体积生理盐水。于造模后24小时处死小鼠,小鼠心脏内取血进行肾功能生化指标检测,摘取小鼠双肾,对其肾脏皮质进行后续研究,造模24小时期间留取小鼠尿液。3.加入NR干预治疗:NR干预组小鼠,给予NR(1mg/g)尾静脉注射每日两次,对照组尾静脉注射等体积生理盐水,连续尾静脉注射5天后,小鼠安乐死,心脏内取血,进行肾功能生化指标检测,摘取小鼠双肾,对其肾脏皮质进行后续研究,造模5天期间留取小鼠尿液。4.组织染色:取材之后,肾脏组织石蜡包埋,切片后进行常规苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin,HE),光镜下观察肾脏皮质组织损伤改变;免疫组化法检测氧化应激及凋亡相关蛋白的表达,应用图片分析软件(Image Pro Plus 6.0)进行统计分析。5.肾功能检测:将留存的小鼠尿液与血液离心,取上清,用ELISA法检测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、尿肌酐以及尿蛋白等肾功能生化指标。6.蛋白质免疫印迹分析(Western-blot):小鼠肾皮质组织充分研磨,裂解液裂解后离心,取上清,提取总蛋白,BCA法测定蛋白质浓度,电泳之后,用湿膜转膜法将蛋白转移至PVDF膜上,浓度为5%的脱脂奶粉封闭2小时,分别孵育特异性一抗,4℃摇床过夜。次日二抗室温孵育1小时,利用AI600化学发光仪显影。7.细胞内超氧化物阴离子水平检测:Dihydroethidium(DHE)溶解于DMSO,配制成适当的母液。用含有2umol/l的DHE适量溶液与组织切片一起在37℃孵育30分钟,装载荧光探针,予以适当洗涤,荧光显微镜下镜检并统计分析。8.抗氧化应激酶活性检测:(1)先配制250mmol/l、5mmol/l H202溶液,再配制显色工作液。冰浴中溶解显色底物,适量分装后使用,按说明书做好样品准备,使用前用Catalase酶检测缓冲液稀释400倍后进行后续测定。先测定标准曲线后,再计算样品中Catalase酶活力。(2)做好样品准备,配制WST-8/酶工作液、反应启动工作液,37℃孵育30分钟,测A450值,计算总MnSOD活力。9.TUNEL染色:肾脏组织固定、包埋、切片、脱蜡至水,滴加20 μg/ml的蛋白酶K,作用30分钟,在样品上加50 μl TUNEL检测液,避光孵育60分钟,封片后荧光显微镜下镜检并统计分析。10.统计学处理:实验中全部计量资料均采用X±S表示,每组实验数据至少重复3次,应用GraphPad Prism 6软件分析所有实验数据。两组均数比较采用独立样本的t检验;单因素方差分析法(One way-ANOVA)分析多组间差异,P<0.05被认为差异有统计学意义。研究结果:1.在CIAKI小鼠模型的肾脏皮质中SIRT3的表达水平升高蛋白质免疫印迹分析结果显示:与空白对照组小鼠相比较,CIAKI小鼠肾脏皮质中SIRT3表达升高。该结果提示,SIRT3可能在CIAKI过程中发挥潜在作用。2.内源性SIRT3缺失加重CIAKI小鼠肾脏皮质病理学损伤组织染色显示两种小鼠(野生型和SIRT3-KO型)CIAKI模型组均发生了典型的肾脏病理学损伤,包括肾间质水肿、大片肾小管上皮细胞胞浆空泡样变、小管上皮细胞刷状缘脱落、蛋白管型的形成,而这种病理学损伤在SIRT3-KO小鼠模型组表现更为严重。上述结果提示:内源性SIRT3缺失加重CIAKI小鼠肾脏皮质的病理学损伤。当应用SIRT3激活剂NR进行干预后,野生小鼠模型组肾脏皮质病理学改变明显减轻,而SIRT3-KO小鼠模型组变化不大,这些表现提示:通过激活剂上调SIRT3,能够减轻造影剂引起的小鼠急性肾损伤组织病理学改变。3.内源性SIRT3缺失加重小鼠CIAKI,NR干预可改善野生小鼠造影剂急性肾功能减低体内实验的第一部分:肾脏功能检测指标对比后发现:两种小鼠CIAKI模型组均出现明显的肾功能损伤;而SIRT3-KO小鼠肾功能损伤更加严重。上述结果提示:内源性SIRT3缺失加重了小鼠的CIAKI。体内实验的第二部分:肾脏功能检测指标对比后发现:(1)分别与其空白对照组相比,野生小鼠模型在加入NR刺激后,血清肌酐和尿素氮水平明显下降,而这种下降趋势在SIRT3-KO小鼠模型组没有出现;(2)在两组NR干预的小鼠中,野生型Cr、BUN水平明显低于SIRT3-KO小鼠。该结果提示通过激动剂上调SIRT3,在CIAKI病理过程中发挥了保护作用。4.内源性SIRT3缺失提高CIAKI小鼠肾脏皮质氧化应激水平用Dihydroethidium进行超氧化物阴离子水平的检测,肾脏皮质内超氧化物阴离子水平较高时,产生的ethidium较多,结果显示SIRT3-KO小鼠模型组切片红色荧光明显强于129野生小鼠模型组。这些表现提示:内源性SIRT3缺失提高了 CIAKI小鼠肾脏皮质氧化应激水平。5.SIRT3调节CIAKI过程中氧化应激相关蛋白的表达免疫组织化学染色结果显示:与野生小鼠模型组相比较,SIRT3-KO小鼠模型组Nox4表达水平显著升高,表明SIRT3基因敲除后体内氧化应激相关蛋白表达增高,提示体内的高ROS水平。同样的实验结果在Western blot法检测中也得到了证实。正常小鼠模型组用来标志SIRT3活性的Acetyl-MnSOD k68表达水平显著下降,表明SIRT3的活性是上升的,而Acetyl-MnSOD k68乙酰化水平在SIRT3-KO小鼠模型组未见明显变化。野生小鼠模型组在加入NR刺激后,通过激活剂上调SIRT3,Acetyl-MnSOD k68表达水平显著下降,而这种蛋白乙酰化水平下降趋势在SIRT3-KO小鼠模型组当中没有出现。上述结果提示:SIRT3调节小鼠CIAKI氧化应激相关蛋白的表达。6.内源性SIRT3缺失减低CIAKI过程中抗氧化应激酶活性两种小鼠(野生型和SIRT3-KO型)分别与其对照组相比较,造影剂的干预显著抑制了抗氧化应激酶Catalase与MnSOD的活性,SIRT3敲除进一步减低了抗氧化应激酶活性;当应用SIRT3激活剂Nicotinamide riboside进行干预时,野生小鼠模型组在加入NR刺激后,Catalase与MnSOD活性显著增强,而这种增强趋势在SIRT3-KO小鼠模型组当中没有出现。上述结果提示:内源性SIRT3缺失减低了抗氧化应激酶活性,导致其氧自由基清除能力下降;而SIRT3激活剂NR能使野生小鼠SIRT3上调,显著减轻了造影剂对抗氧化应激酶Catalase与MnSOD活性的抑制。7.内源性SIRT3缺失加重CIAKI小鼠的细胞凋亡TUNEL染色结果显示,两种小鼠模型组分别与其对照组相比较,均出现了明显的细胞凋亡;而两组模型组之间比较,SIRT3-KO小鼠模型组细胞凋亡更加严重。这些表现提示:内源性SIRT3缺失加重CIAKI小鼠的细胞凋亡。8.SIRT3调节CIAKI过程中凋亡相关蛋白的表达免疫组织化学染色结果显示:与129野生小鼠模型组相比较,SIRT3-KO小鼠模型组促凋亡分子Bax表达明显上调和抗凋亡分子Bcl-2表达下调,Bcl-2/Bax比值下降,同时凋亡过程中关键酶Caspase3的表达上调。在蛋白质免疫印迹分析结果同样显示,SIRT3-KO小鼠模型组促凋亡分子Bax表达上调和抗凋亡分子Bcl-2表达下调,Bcl-2/Bax比值下降以及凋亡关键酶Caspase3表达的上调。上述结果表明:SIRT3调控CIAKI过程中凋亡相关蛋白的表达。结论:1.SIRT3在造影剂急性肾损伤小鼠模型中表达升高;2.内源性SIRT3缺失加重小鼠造影剂急性肾损伤;3.SIRT3可能通过调节氧化应激和凋亡调控造影剂急性肾损伤。研究背景:伴随各大医疗机构增强CT检查及动脉介入治疗等诊疗手段的迅猛发展,CIAKI已经发展成为院内获得性肾损伤主要病因之一。CIAKI发生后,不但延长患者的住院时间,提高了诊疗费用,而且显著增加了患者的病死率。截至目前,造影剂急性肾损伤发病机制仍未完全阐明,目前预防措施中除水化疗法之外,尚无有效的措施来预防和治疗CIAKI的发生。因此,造影剂急性肾损伤已经成为放射、心血管以及肾脏病领域相关专家共同关注的问题。CIAKI发病机制目前尚未完全阐明,多数观点认为其主要的发病机制包括活性氧自由基(ROS)、造影剂对肾小管上皮细胞的直接毒性以及肾缺血缺氧等。研究显示,造影剂能够抑制抗氧化应激酶的活性,直接导致氧自由基的大量产生,加重肾脏组织中氧自由基的蓄积,氧自由基的大量增加直接对肾小管上皮细胞产生毒性损害而导致肾脏损伤。实验研究已经表明,氧化应激可以通过影响线粒体通透性,诱导肾小管上皮细胞凋亡,这也强烈提示了氧化应激与凋亡之间的密切关系。凋亡作为组织细胞的一种基本生物学现象,是一个主动过程,它涉及到一系列基因的激活、表达以及调控,它是机体为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡进程。凋亡关键酶Caspase3是整个凋亡过程中的关键酶,对其底物产生有限不可逆地降解,细胞凋亡的过程就是该过程的级联放大反应。Bax是一种促进细胞凋亡的蛋白质,当其与Ku70稳定结合状态被打破时,能够激活凋亡关键酶Caspase3促进凋亡的发生。Bcl-2是一种重要的细胞凋亡负性调节因子,通过减少细胞色素C的释放,对凋亡关键酶Caspases3起到调控作用,进而产生抑制细胞凋亡的作用。NAD+依赖的SIRT3作为Sirtuins家族中目前实验研究最多的去乙酰化酶,在线粒体能量代谢以及线粒体功能中发挥着极其重要的作用。大量实验研究已经证实,SIRT3通过其去乙酰化活性,调节了许多线粒体活动,包括信息传递、抑制基因组变异、能量生成和细胞分化等,在线粒体的活动中扮演了重要的角色。SIRT3能去乙酰化Fox03 α导致抗氧化应激相关酶,如锰超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等抗氧化酶表达的上调。已有研究证实,SIRT3可以保护应激状态心肌细胞,这种作用同样在顺铂导致的心肌损伤动物模型中被确认。在CIAKI发病机制中肾小管上皮细胞氧化应激以及凋亡占主导地位,而去乙酰化酶SIRT3能够影响线粒体氧化应激过程,进而影响细胞内众多的生物学进程。所以本课题通过探究去乙酰化酶SIRT3对造影剂急性损伤过程中HK-2(肾小管上皮细胞)氧化应激及凋亡中的作用,初步探讨SIRT3在该损伤过程HK-2中的作用及相关机制,为临床预防治疗CIAKI带来新的思路,为设计以SIRT3为作用靶点的新型药物提供理论支持及实验依据。研究目的:1.探讨SIRT3在造影剂介导的HK-2细胞损伤中表达的变化;2.探讨SIRT3对造影剂介导的HK-2细胞氧化应激过程的影响;3.探讨SIRT3对造影剂介导的HK-2细胞凋亡的影响。研究方法:1.细胞培养、处理及分组:将复苏后的人肾小管上皮细胞株(HK-2)接种于低糖型DMEM培养基中,置于37℃C、5%C02细胞孵育箱常规培养,饥饿细胞12小时使细胞同步化,SIRT3小干扰RNA转染后,将细胞分为HK-2和SIRT3-siRNA HK-2细胞,按照是否加入碘佛醇分为:HK-2+Vehicle组、HK-2 siRNA+Vehicle组、HK-2+Ioversol组和HK-2 siRNA+Ioversol四组,其中干预组分别加入碘佛醇刺激30分钟换液后在细胞孵育箱继续孵育24小时。2.蛋白质免疫印迹分析(Western-blot):HK-2细胞进行充分研磨,用裂解液裂解HK-2细胞后离心,取上清液,提取总蛋白,BCA法测定蛋白质的浓度,电泳之后,用湿膜转膜法将蛋白转移至PVDF膜上,浓度为5%的脱脂奶粉封闭2小时,分别孵育特异性一抗,4摄氏度摇床过夜。次日二抗室温孵育1小时,利用AI600化学发光仪显影。3.抗氧化应激酶活性检测:(1)先配制250mmol/l、5mmol/l H2O2溶液,再配制显色工作液。冰浴溶解显色底物,适当分装后使用,按说明书做好样品的准备,使用前用Catalase酶检测缓冲液稀释400倍后进行后续测定。先测定标准曲线后,再计算样品中Catalase酶活力。(2)按说明书做好样品的准备,配制WST-8/酶工作液、反应启动工作液,37℃孵育30分钟,测A450值,计算总MnSOD活力。4.DCFH-DA法测定HK-2细胞中ROS水平:按照1:1000用无血清培养基稀释DCFH-DA,去除细胞培养基,加入含终浓度为10umol/lDCFH-DA的无血清培养基1mL,37℃、5%CO2细胞孵育箱中培养20分钟。用无血清培养基洗涤细胞3次,用100mgI/ml的碘佛醇刺激30分钟后,弃去原培养基,用PBS清洗3遍后,放置于激光共聚焦显微镜下观察ROS的荧光强度并拍照统计分析。5.统计学处理:实验中全部计量资料均采用X±S表示,每组实验数据至少重复3次,应用GraphPad Prism 6软件分析所有实验数据。两组均数比较采用独立样本的t检验;单因素方差分析法(One way-ANOVA)分析多组间差异,P<0.05被认为差异有统计学意义。研究结果:1.SIRT3在造影剂介导的HK-2细胞损伤中表达水平升高Western blot结果显示,与空白对照组相比较,HK-2细胞干预组的SIRT3表达水平明显升高。本实验结果提示:SIRT3可能在造影剂介导的HK-2细胞损伤中发挥潜在作用。2.SIRT3调节造影剂介导的HK-2细胞氧化应激相关蛋白的表达Westem blot结果显示,使用SiRNA转染抑制SIRT3表达后,造影剂干预导致HK-2细胞Nox4表达水平较对照组显著升高,导致细胞内ROS水平升高;在正常细胞干预组中,用来标志SIRT3活性Acetyl-MnSOD k68表达水平显著下降,SIRT3的活性是上升的,而这种蛋白乙酰化水平下降趋势在SIRT3抑制组没有出现。上述结果提示:SIRT3调节造影剂介导的HK-2细胞氧化应激相关蛋白的表达。3.SIRT3调控造影剂介导的HK-2细胞凋亡相关蛋白的表达蛋白质免疫印迹分析结果显示,SIRT3表达被抑制后,表现为促凋亡分子Bax表达上调和抗凋亡分子Bcl-2表达下调,Bcl-2/Bax比值下降以及关键酶Caspase3表达的上调。上述结果提示:SIRT3调控造影剂介导的HK-2细胞凋亡过程中相关蛋白表达。4.SIRT3低表达减低造影剂介导的HK-2细胞损伤中抗氧化应激酶活性与空白对照组相比较,造影剂的干预显著抑制了抗氧化应激酶Catalase与MnSOD的活性,在造影剂介导的HK-2细胞损伤中,SIRT3的表达下降进一步减低了抗氧化应激酶活性。上述结果提示:SIRT3低表达减低抗氧化应激酶活性,导致HK-2细胞氧自由基清除能力下降。5.SIRT3低表达提高造影剂介导的HK-2细胞氧化应激水平DCFH-DA法测定HK-2细胞中ROS水平,在造影剂介导的HK-2细胞损伤过程中,SIRT3低表达HK-2细胞的ROS水平显著高于正常HK-2细胞组。上述表现提示:SIRT3低表达提高了造影剂介导的HK-2细胞氧化应激水平。结论:1.SIRT3在造影剂介导的HK-2细胞损伤中表达升高;2.SIRT3低表达提高造影剂介导的HK-2细胞氧化应激水平;3.SIRT3调节造影剂介导的HK-2细胞凋亡相关蛋白的表达。