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【研究背景】帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种起病隐匿,危害严重的神经退行性疾病（Neurodegenerative diseases,NDDs）,其主要病理改变为黑质纹状体多巴胺能（Dopaminergic,DA）神经元的不可逆丢失和路易氏小体（Lewybody）的形成[1]。PD的临床表现主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍,当患者出现这些症状时,现有的治疗手段无法恢复受损的DA神经元[2,3],所以对PD进行早期诊断并追踪其疾病进展颇为重要。然而,PD早期的影像学表现无明显特异性[4],所以对患者体液中的生物标志物进行检测以监测PD的疾病阶段是一个有效的方法。由于抽取脑脊液损伤性大,而唾液、尿液虽然取样方便,但其中有诊断价值的标志物较少[5,6],因此检测血液（血清）中的生物标志物是辅助诊断PD的主要手段之一。α突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）是PD早期诊断及疾病进展标志物研究的热点,但目前多种研究表明α-syn在外周血中表达水平高低不一,且易产生假阳性[7,8],因此筛选血液中具有诊断潜力的小分子物质有重要意义。Micro RNA（mi RNA）是一段长度在18～22 bp的非编码小RNA,其在不同疾病中的水平变化已经成为揭示疾病发生发展的重要指标之一[9]。但是外周血mi RNA容易受到循环中多种物质尤其是RNA酶（RNase）的影响,不能准确反应中枢神经系统（Central nervous system,CNS）的情况[10]。因此,如何提高mi RNA在PD等NDDs中的诊断价值,是当下研究的重要方向。外泌体是一种直径约为30～150 nm的细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）,在人的各种体液中均被发现,是细胞间通讯的关键要素之一[11]。外泌体拥有较为稳定的内部环境,可以自由通过血脑屏障,其中富含的各种蛋白质、脂质、核酸等物质,在疾病诊断中发挥了重要作用[12]。对mi RNA而言,外泌体可以富集mi RNA以避免其被RNase降解[10,13],从而使它们的表达量和生物学功能维持在较为稳定的水平,能够充分反映CNS的生理病理状态[11,12]。以上均表明,外泌体中的mi RNA在NDDs的诊断中有着独特价值。【研究目的】本研究的主要目的是通过生物信息学和生物学手段筛选血清外泌体mi RNA作为识别PD不同分期的具有生物学“共性”和“个性”特点的诊断标志物,为PD的早期诊断和监测PD的进展提供支撑。【研究方法】1.提取PD患者和正常对照组外周血后,通过超速离心法提取外泌体,并运用免疫印迹（Western Blot,WB）和透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）技术进行质量控制,随后提取样品中RNA进行高通量测序,并绘制高斯核密度分布图评价测序结果,最后对经M值的加权截尾均值（Trimmed mean of M value,TMM）法标准化处理后的测序数据进行mi RNA差异表达分析。2.根据需求选择各分期差异表达mi RNA,通过加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）构建并可视化共表达网络,随后建立分期间模块连接和对各期进行功能富集分析进一步筛选模块和mi RNA,最后通过比对人类mi RNA疾病数据库（Human mi RNA Disease Database,HMDD,http://www.cuilab.cn/hmdd/）中的PD相关mi RNA确定与各期均相关和各期特异性相关的mi RNA。3.运用受试者工作特性（Receiver operating characteristic,ROC）曲线分析通过WGCNA筛选出的mi RNA对不同分期PD的鉴别能力,再次收集PD患者和正常对照组外周血样本并提取血清外泌体,运用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,q RT-PCR）检测这些mi RNA在不同分期的特异性表达情况,最终确定能够诊断PD发病全程和PD各期的特异性mi RNA。【研究结果】1.WB检测待测样品中仅表达外泌体相关标志物蛋白CD63、TSG101和CD81,而GAPDH仅在细胞样品中表达,TEM下待测样品呈现出直径为100 nm左右的茶托状结构,证明提取样品的确为外泌体。对样品测序结果绘制高斯核密度分布图显示,每百万碱基対对数值（Log2 counts per million,Logcpm）落在-5～15区间范围内,说明测序数据质量良好。将测序数据标准化后,运用差异表达分析中的edge R方法和t检验,共得到了185个差异表达的mi RNA。2.选择全部的差异表达mi RNA,对每个阶段（control、Ⅱ期、Ш期和Ⅳ期）使用WGCNA构建共表达网络,并将经聚类树剪切生成的模块可视化,在control组得到了9个有效模块,在Ⅱ期得到了7个有效模块,在Ш期得到了7个有效模块,在Ⅳ期得到了11个有效模块。随后通过建立模块间连接进一步筛选相关模块和相关mi RNA,得到了21个模块和114个mi RNA。再将结果比对到HMDD中的PD相关mi RNA,最终确认了11个PD相关性模块和30个PD相关性mi RNA,其中,4个mi RNA与Ⅱ、Ш、Ⅳ期均相关。接下来选择仅在各期特异性表达的mi RNA,再次对每个阶段使用WGCNA构建共表达网络,经模块可视化后,在Ⅱ期得到了11个有效模块,在Ш期得到了8个有效模块,在Ⅳ期得到了9个有效模块。随后对每个阶段内部模块中的mi RNA进行功能富集分析,保留下错误发现率（False discovery rate,FDR）＜0.05的功能条目,随后选取了15个与PD发生发展密切相关的生物学功能,保留下它们对应的mi RNA及其所在模块,得到了18个模块和88个mi RNA。最后将结果比对到HMDD中PD相关mi RNA,最终确认了16个PD相关性模块和25个PD相关性mi RNA。其中,3个mi RNA仅与Ⅱ期相关,1个mi RNA仅与Ш期相关,9个mi RNA仅与Ⅳ期相关,共13个。这样一共初步筛选出了17个mi RNA。3.运用ROC曲线分析通过WGCNA筛选出的17个mi RNA对不同分期PD的鉴别能力,一共筛选出了7个mi RNA。其中,2个能够鉴别出Ⅱ、Ш、Ⅳ期PD和正常对照组,1个能够鉴别出Ⅱ期和其它分期,1个能够鉴别出Ш期和其它分期,3个能够鉴别出Ⅳ期和其它分期;同时,按照相同标准再次纳入了40例PD患者和正常对照,提取血清外泌体并对WGCNA筛选出的17个mi RNA运用q RT-PCR实验检测其表达水平,一共筛选出了7个mi RNA。其中,2个在Ⅱ、Ш、Ⅳ期均表达,2个仅在Ⅱ期特异性表达,1个仅在Ш期特异性表达,2个仅在Ⅳ期特异性表达。通过上述两种方法一共筛选出了8个mi RNA,为了明确这些mi RNA是否仅在血清外泌体中表达,我们还检测了这8个mi RNA在血清中的表达情况,发现有2个mi RNA也在血清中表达,而剩下的6个mi RNA则未在血清中表达。【研究结论】在本研究中,我们根据赫-雅（Hoehn＆Yahr,H＆Y）分期,收集原发性PD各种不同分期的病人（Ⅱ期,Ш期,Ⅳ期）和正常对照的血清,采用差速离心法提取外泌体,进行小RNA高通量测序获得原始数据,将之标准化后得到185个差异表达的mi RNA。采用WGCNA数据分析方法构建共表达网络并筛选出与PD发病全程相关和各期特异性相关的17个mi RNA。最后运用ROC曲线分析和q RT-PCR实验对这17个mi RNA进一步筛选,并在血清中检测其表达情况,最终得到了6个仅在血清外泌体中表达的mi RNA,它们是hsa-mi R-374a-5p、hsa-mi R-374b-5p、hsa-mi R-199a-3p、hsa-mi R-28-5p、hsa-mi R-22-5p和hsa-mi R-151a-5p。其中,hsa-mi R-374a-5p和hsa-mi R-374b-5p有诊断Ⅱ、Ш、Ⅳ期PD的价值,hsa-mi R-199a-3p有诊断Ⅱ期PD的价值,hsa-mi R-28-5p有诊断Ш期PD的价值,hsa-mi R-22-5p和hsa-mi R-151a-5p有诊断Ⅳ期PD的价值。它们反映了PD不同分期生物学特点的“共性”和“个性”,为PD的分期诊断和治疗提供了新的靶点。