家蚕squid基因的原核表达和定位分析

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BmSQD-1蛋白(Bombyx mori SQIYID protein)首次在家蚕中进行研究。BmSQD-1蛋白含有两个RRM保守结构域,RRM基序中含有许多保守的氨基酸,RRM RNA结合蛋白,参与RNA前体的剪接,RNA的细胞定位及保持RNA的稳定性等多种转录后调控过程,人体中RRM RNA结合蛋白与某些人类遗传性疾病及肿瘤相关。果蝇中squid基因编码一些核不均-核糖核蛋白的亚型,通过RNA的选择性剪切编码至少三种蛋白,分别包含345,321,308个氨基酸残基。每种亚型拥有共同的前285个氨基酸残基,共同的N末端有两个RNA结合基序,这些蛋白质是hnRNP复合物的主要组成成分。推测BmSQD-1蛋白即为一类核不均-核糖核蛋白。   我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,该基因序列长为864bp,编码268个氨基酸残基,预测分子量为30.99kDa。将该基因的ORF克隆到大肠杆菌载体pET-28a(+)中,构建了原核表达质粒pET-28a(+)-Bmsqd-1,并转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后SDS-PAGE检测,发现在约35kDa处有一特异性条带,经重组质粒测序和质谱检测表明表达的重组蛋白完全正确。超声裂解菌体离心,SDS-PAGE检测,发现融合蛋白存在于上清中。采用亲和层析的方法纯化融合蛋白,以纯化的重组蛋白免疫雄性新西兰兔,制备了该重组蛋白的多克隆抗体,并用Protein A凝胶柱纯化多克隆抗体。ELISA检测结果表明该抗血清的效价可达到1:12800以上。通过Western blotting分析,发现BmSQD-1在家蚕五龄幼虫的马氏管表达量最高,卵巢次之,表皮最低。实时定量PCR的结果表明,家蚕Bmsqd-1 mRNA在家蚕的各个发育时期和各个组织中广泛分布:以卵中的转录量最高,蛾的转录量最低。通过免疫荧光法分析了BmSQD-1的亚细胞定位分析,BmSQD-1存在于细胞核中,细胞质中不存在BmSQD-1。
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学位
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