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1型糖尿病(Type1 diabetes mellitus,T1DM)患者的心功能受到各种病理过程的影响,包括加速的动脉粥样硬化和心脏自主神经病变及心肌病变。这种在T1DM基础上发生的心肌病变,称其为1型糖尿病心肌病(Type1 DiabeticCardiomyopathy,T1DCM),它是糖尿病直接影响心肌的结果,独立于冠心病和高血压等心脏病,其自然病史是一个潜在的亚临床期,期间心肌细胞逐渐受到侵蚀,缓慢地出现心肌纤维化和心肌肥厚。
在这种心肌肥厚过程中,高糖高胰岛素血症可能起了重要作用,并与心肌细胞内蛋白的合成及心肌细胞肥大有关,但其中发生发展机制目前尚不完全清楚。缺氧诱导因子1a(hypoxia inducible factor1 alpha,HIF-1a)是机体维持氧自稳平衡的核心调控因子之一的缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor1,HIF-1)的调节和活性的亚基,可调控血管内皮生长因子、促红细胞生成素等基因的表达。常氧条件下,胰岛素可通过激活蛋白激酶B(protein kinase B,PKB or Akt)增加HIF-1a的蛋白表达水平,由于胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate1,IRS1)是胰岛素与其受体结合发挥生物学效应的一个重要介质,通过与HIF-1a进行相关分析,并应用siRNA干扰沉默HIF-1a基因,进而探讨HIF-1a和IRS-1与高糖高胰岛素诱导的心肌细胞肥大之间的关系,为寻找与发生T1DCM相关的机制及治疗靶点提供了新的思路。
目的：
本研究通过体外培养的大鼠乳鼠心肌细胞,在高糖高胰岛素刺激下,出现了心肌细胞肥大,采用实时定量聚合酶链反应(real time PCR)检测肥大的心肌细胞中的HIF-1a mRNA表达情况,并用细胞免疫组织化学实验方法检测肥大的心肌细胞中HIF-1a和IRS-1蛋白的变化情况,并以细胞免疫荧光和图像分析软件检测的心肌细胞面积及BCA蛋白定量试剂盒检测的蛋白含量等心肌细胞肥大指标以反映siRNA沉默HIF-1a基因(HIF-1a-siRNA干扰)对心肌细胞肥大的治疗效果。探讨HIF-1a-siRNA干扰对T1DCM肥大心肌细胞的影响,并且通过与IRSI进行相关分析,进而探讨其在高糖高胰岛素诱导下心肌细胞肥大的相关机制。
方法：
采用SPF级Wistar大鼠乳鼠心肌细胞,随机分成六组:正常对照组(A组)、高糖培养组(B组)、高糖高胰岛素培养组(C组)和高糖高胰岛素+HIF-1a-siRNA培养组(D组)、脂质体对照组(E组)和阴性错配对照组(F组)。所有培养组均用含10％胎牛血清的DMEM低糖培养液培养48h后,进行相应的等量干预。A组加入不含胎牛血清的低糖DMEM培养液(5.5mmol/L葡萄糖);B组加入不含胎牛血清的高糖DMEM培养液(25.5mmol/L葡萄糖);C组加入不含胎牛血清的高糖高胰岛素DMEM培养液(25.5mmol/L葡萄糖+10-7mol/L,胰岛素);D组加入不含胎牛血清的含siRNA-Lip混合液的DMEM高糖高胰岛素培养液;E组加入不含胎牛血清的含Lip-2000的DMEM高糖高胰岛素培养液;F组加入不含胎牛血清的含错配的siRNA-Lip的DMEM高糖高胰岛素培养液。每组在干预后设0h、24h、48h三个观察时间点,并于观察时间点时处理心肌细胞,取心肌细胞分别进行Real Time PCR、细胞免疫组化、细胞免疫荧光和BCA蛋白定量检测。
结果：
(1)从0h～48h,在倒置显微镜下,观察到的心肌细胞形态变化,并得到了活力强的心肌细胞(平均搏动频率为118次/分钟,平均搏动率为91.6％)。
(2)对于三条siRNA及错配siRNA进行同步同法转染48h后,根据显微镜下,观察免疫荧光情况,评估心肌细胞转染效率,筛选出一条转染效率至少80％的siRNA。
(3)C组心肌细胞的表面积和心肌细胞内蛋白含量比A和B组明显增加(P＜0.01),而D组心肌细胞的表面积和心肌细胞内蛋白含量比C组明显减少(P＜0.01)。
(4)C组心肌细胞内HIF-1a mRNA表达量比A和B组明显增多(P＜0.01),D组心肌细胞的HIF-1a mRNA表达量比C组明显减少(P＜0.01)。
(5)C组心肌细胞内HIF-1a蛋白量比A和B组明显增加(P＜0.01),D组心肌细胞的HIF-1a蛋白量比C组明显减少(P＜0.01)。
(6)C组心肌细胞内IRSI蛋白量比A组明显减少(P＜0.01),D组心肌细胞内IRSl蛋白量比A组明显减少(P＜0.01),而D组心肌细胞内IRS1蛋白量与C组相比无明显变化(P＞0.05)。
(7)在A、B和C三组中,心肌细胞中HIF-1a蛋白表达量与IRS-1蛋白表达量呈一定的负相关性,相关系数r=-0.637。
结论：
1.高糖高胰岛素刺激下,心肌细胞表面积和心肌细胞内蛋白含量增多,间接反映了心肌细胞肥大,并伴随HIE-1a表达增多,IRS-1表达减少;HIF-1a-siRNA通过减少HIF-1a表达,可部分抑制由高糖高胰岛素引起的心肌细胞肥大。
2.在肥大的心肌细胞中,HIF-1a蛋白表达量与IRS-1蛋白表达量呈一定的负相关性,推测HIF-1a可能通过IRS/PI3K/Akt细胞信号转导通路与高糖高胰岛素所致心肌细胞肥大有关,但具体作用机制尚需深入研究。