昆虫不育技术(Sterile insect technique,SIT)是一种害虫绿色防控技术,已经被应用于农林牧业及医学卫生害虫防治。相对于传统的害虫化学防治,SIT具有物种特异性和环境友好的优点。辐照源昆虫不育技术已经成功用于包括实蝇在内的多种害虫防控,防治策略包括预防、害虫种群压制及根除。昆虫不育技术大规模成功实施主要依赖于两个重要方面:(1)低成本条件下快速扩繁,获得足够数量的昆虫;(2)获得高质量不育雄虫,即在野外具有良好的适应力和交配竞争力。然而,已经有研究报道辐射源实蝇类和蚊虫的不育雄虫与野外雄虫竞争雌虫时候在交配竞争力等方面处于劣势,但不育雄虫野外生态适应力下降的原因和机制尚不清楚。昆虫共生微生物可以影响宿主的生长发育、营养吸收、繁殖、中枢神经发育以及行为。研究发现电离辐射能够改变宿主肠道微生物稳态,但肠道微生物是否与不育雄虫的生态适应下降存在关联,以及肠道微生物在这其中的作用机制尚不明确。本研究以橘小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)为研究对象,利用高通量16S rRNA基因扩增子测序技术、无菌幼虫饲养技术、细菌基因组学、λ-Red同源重组系统、转录组学和代谢组学等分子生物学手段和高通量测序技术研究了橘小实蝇肠道微生物群落结构与多样性及其对宿主幼虫生长发育,也探究了肠道微生物在橘小实蝇不育雄虫的生态适应力辐照损伤的修复功能及其潜在机制。主要研究结果如下:1.橘小实蝇幼虫肠道微生物群落结构与多样性通过高通量16S rRNA基因扩增子测序系统地调查了橘小实蝇幼虫肠道微生物群落组成结构及其随着龄期增加的动态变化规律,结果发现肠杆菌科Enterobacteriaceae、链球菌科Streptococcaceae、全孢菌科Holosporaceae和明串珠菌科Leuconostocaceae以较高的丰度稳定的存在于不同龄期幼虫肠道中,而以芽孢杆菌科Bacillaceae为代表的次要菌群随着幼虫龄期增加而显著下降。随着幼虫的生长发育,其肠道微生物群落的丰富度和多样性具有逐渐降低的趋势。通过可培养菌技术发现橘小实蝇幼虫肠道稳定存在的可培养细菌主要是属于肠杆菌科的普罗维登氏菌属Providencia、摩根氏菌属Morganella和肠杆菌属Enterobacter以及属于乳酸菌类群的明串珠菌属Leuconostoc、乳杆菌属Lactobacillus和Fructobacillus细菌。2.橘小实蝇幼虫肠道微生物促进幼虫生长发育及其机制通过无菌生物学技术、单菌回补实验及细菌基因组关联分析,研究了27种细菌对橘小实蝇幼虫生长发育的影响。通过无菌生物学技术研究发现在低营养条件下,有菌幼虫组(AXA)体长显著高于无菌组幼虫(AX),肠道微生物存在有利于幼虫生长发育。单菌回补实验发现,相比于AX组幼虫体长(3.79±0.10 mm),橘小实蝇幼虫肠道分离的7个肠杆菌科菌株Enterobacter cloacae N29(9.56±0.16 mm)、Morganella morganii V41(8.31±0.29 mm)、Providencia alcalifaciens V29(7.44±0.66 mm)、Providencia rettgeri V2(6.46±0.46 mm)、Providencia stuartii N83(6.41±0.14 mm)、Morganella morganii N94(6.07±0.25 mm)和Klebsiella quasipneumoniae N46(5.78±0.09 mm),橘小实蝇成虫5个肠道肠杆菌科菌株Enterobacter hormaechei EH(7.92±0.34 mm)、Enterobacter soli EA(8.02±0.12 mm)、Klebsiella michiganensis BD177(5.96±0.10 mm)、Citrobacter koseri BD195(6.52±0.09 mm)和Serratia nematodiphila SM(4.44±0.18 mm),以及其他环境来源的3个肠杆菌科菌株Klebsiella michiganensis KM700324(5.83±0.16 mm)、Citrobacter portucalensis CF2(5.24±0.19 mm)和肠杆菌科菌株Escherichia coli EC(4.76±0.08 mm)均对无菌组(AX)幼虫生长有一定的促进作用,其中回补喂食幼虫肠道细菌N29、V41、V29、EH和EA的幼虫长度甚至显著高于AXA组幼虫,特别是N29菌株对幼虫生长促进效果最为显著。此外,橘小实蝇幼虫肠道分离的2个乳酸菌类菌株Lactobacillus plantarum M96(5.25±0.50 mm)和Leuconostoc citreum M58(4.50±0.27 mm)对于无菌组(AX)幼虫也具有一定促进作用。而橘小实蝇幼虫肠道次要菌群菌株Psychrobacillus soli N105(3.10±0.29 mm)和黑腹果蝇的病原菌菌株Erwinia carotovora ECC15(2.79±0.17 mm)则对幼虫生长有显著抑制作用。其它待测的8种细菌对幼虫生长发育无显著影响。通过二代高通量测序获得了上述27个菌株的基因组信息,进一步的细菌全基因组与表型关联分析发现,KEGG通路中的氨基酸合成和代谢、脂多糖生物合成、脂肪酸降解、维生素合成、生物膜形成、氧化磷酸化作用以及硫代谢相关通路与幼虫生长呈显著正相关。通过细菌基因敲除实验,结果发现相对于AX组无菌幼虫(5.52±0.29 mm),野生型菌株N29＿WT与幼虫关联后体长(8.76±0.21 mm)显著增加了58.70%,而N29菌株中维生素B6生物合成通路基因pdx A(6.55±0.3 mm)和酪氨酸代谢通路基因p＿hpc E(6.21±0.28 mm)分别缺失均能导致其丧失对幼虫生长的促进作用,N29菌株的酪氨酸代谢通路中的hpc E基因(6.82±0.21 mm)的缺失则导致其对幼虫生长的促进作用显著降低。因此酪氨酸代谢和维生素B6合通路在N29菌株促进橘小实蝇幼虫生长中具有重要作用。3.肠道共生菌修复橘小实蝇不育雄虫的生态适应力辐照损伤及其潜在机制我们发现γ辐照导致橘小实蝇雄虫交配竞争力、飞行能力和生存能力等生态适应力显著下降。在雄虫羽化后第14天,与未辐照雄虫相比,辐照雄虫的累计飞行时间(p<0.01)、累计飞行距离(p<0.05)、平均飞行速度(p<0.005)、最高飞行速度(p<0.001)均显著降低。在羽化第14天的竞争交配实验中,只有31%的雌虫与辐照的雄虫成功交配显著低于69%雌虫与未辐照雄虫成功交配(p<0.0001)。与未辐照雄虫51天的中位生存时间相比,辐照处理将雄虫的中位生存时间降低到30天,大约降低了46%。通过高通量16S rRNA基因扩增子测序和可培养菌技术分析表明,经过辐照处理后橘小实蝇肠道菌群的组成和结构发生显著变化。与未辐照雄虫相比,在羽化后第7天辐照雄性的肠道微生物群落的物种数Observe、Chao1指数、ACE指数和Shannon指数显著升高,而Simpson指数则显著降低。肠道微生物群落结构组成分析发现肠道主要菌群Enterobacteriaceae细菌的相对丰度和细菌载量均显著降低,而肠道次要菌群(Bacillus aceae、Clostridiaceae、Xanthomonadaceae、Sphingobacteriaceae、Aeromonadaceae、Flavobacteriaceae)的相对丰度显著增加。而在可培养菌分析中发现辐照处理雄虫肠道中Citrobacter koseri BD195、Klebsiella michiganensis BD177和Enterobacter soli BD400的相对丰度较未辐照组分别下降了81.82%、54.17%和33.75%。因此,我们推测辐照处理后橘小实蝇生态适应性的显著下降可能与宿主肠道微生物群落结构及组成发生改变存在密切关系。通过回补喂食肠道共生菌C.koseri BD195和K.michiganensis BD177,发现K.michiganensis BD177能够显著修复不育雄虫生态适应力的辐照损伤,而肠道共生菌C.koseri BD195则无显著修复功能。回补喂食K.michiganensis BD177菌株的辐照不育雄虫的交配竞争力、飞行能力、存活率和寿命等生态适应力均可恢复到未辐照的正常雄虫水平。在羽化后第7天,喂食BD177菌株的辐照雄虫的累计飞行距离和最快的飞行速度是未喂食BD177菌株的辐照雄虫的1～2.5倍。喂食BD177的辐照雄虫成功与47%的雌虫交配,与未辐照的正常雄虫成功交配的雌虫数量(53%)无显著差异。与未辐照雄虫相比,喂食BD177的辐照雄虫寿命明显长于未喂食BD177的辐照雄虫,而与未辐照雄虫之间没有显著差异。进一步实验发现辐照导致橘小实蝇雄虫的取食能力和血淋巴中主要营养物质水平显著下降,通过喂食K.michiganensis BD177菌株显著恢复了辐照雄虫的食物摄取量和主要营养素水平。在羽化后第1天,辐照雄虫的取食量(p=0.0141)、血淋巴中总糖(p=0.0247)和总游离氨基酸(p=0.0144)均显著低于未辐照雄虫组。在羽化后第7天,未喂食BD177的辐照雄虫的食物摄入量和血淋巴中的主要营养素(糖和氨基酸)水平也持续显著低于对照组未辐照雄虫,而喂食BD177的辐照雄虫取食量(p=0.0475)和游离氨基酸总量(p=0.0124)显著高于未喂食BD177的辐照雄虫。这些结果表明K.michiganensis BD177菌株可能是通过改变橘小实蝇不育雄虫的取食行为以及营养吸收代谢能力从而修复不育雄虫生态适应力的辐照损伤。因此我们进一步通过转录组、代谢组以及K.michiganensis BD177基因组联合分析发现,回补K.michiganensis BD177后宿主KEGG通路尸首组织转录水平和血淋巴代谢水平的响应中主要存在有苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成途径,并且K.michiganensis BD177菌株特有基因主要映射的KEGG通路也存在有苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成通路,因此我们认为苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成途径可能在K.michiganensis BD177提高不育雄虫生态适应力过程中具有重要作用。K.michiganensis BD177菌株可在橘小实蝇昆虫不育技术中作为益生菌,修复不育雄虫的生态适应力辐照损伤,提高昆虫不育技术的实施效率。