鸢尾素(irisin)是Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5 (FNDC5)的翻译后加工产物,可以结合白色脂肪细胞的未知受体,促进白色脂肪棕色化。目前关于irisin亚细胞定位机制的研究处于起步阶段,且其促进白色脂肪棕色化的作用机制有待进一步探索。本研究通过检测FNDC5信号肽和跨膜结构域的定位功能,了解其对irisin亚细胞定位的影响；针对FNDC5的剪切和N-连接糖基化修饰进行研究,揭示irisin的亚细胞定位机制；利用原核表达的GST-irisin处理小鼠白色脂肪细胞,探索irisin促进白色脂肪棕色化的作用机制。(1) FNDC5信号肽和跨膜结构域定位功能的检测为检测FNDC5信号肽和跨膜结构域的定位功能,了解信号肽和跨膜结构域对irisin定位的影响,本研究使用Phobius程序分析FNDC5信号肽,使用SignalP 4.1 Server程序分析FNDC5的跨膜结构域。根据分析结果,分别构建信号肽表达载体pEGFP-SP、跨膜结构域表达载体pEGFP-TM和FNDC5表达载体pFNDC5-EYFP,转染HeLa细胞,观察融合蛋白的亚细胞定位。亚细胞定位结果表明：EGFP-SP定位在内质网,EGFP-TM定位于细胞膜,FNDC5-EYFP在细胞膜发出黄色荧光。以上结果表明FNDC5信号肽具有内质网定位功能,跨膜结构域能够将irisin定位于细胞膜。(2) FNDC5剪切作用及irisin分泌过程的研究为探索FNDC5可能存在的蛋白质剪切作用,检测irisin如何分泌到细胞外,本研究构建pEGFP-FNDC5和pDsred2-FNDC5-EGFP表达载体,转染HeLa细胞,分别观察融合蛋白及其剪切产物的亚细胞定位。使用GFP抗体对EGFP-FNDC5、 FNDC5-EYFP和Dsred2-FNDC5-EGFP蛋白及其剪切产物进行Western blotting检测,观察融合蛋白剪切产物的相对分子量。结果表明：FNDC5在信号肽和跨膜结构域处发生两次剪切。切除信号肽的FNDC5在跨膜结构域的作用下定位于细胞膜,随后经过跨膜结构域处的剪切,irisin被分泌到细胞外。因此FNDC5的剪切是鸢尾素分泌的前提。(3) FNDC5蛋白N-连接糖基化修饰的检测为了验证FNDC5的N-连接糖基化修饰,本研究使用糖苷酶PNGase F和糖苷酶Endo H分别酶切肌肉组织总蛋白,使用irisin单克隆抗体对经糖苷酶酶切的肌肉组织总蛋白进行Western blotting检测。结果表明：FNDC5蛋白存在PNGase F和Endo H敏感的N-连接糖基化修饰,因此FNDC5是N-连接糖基化修饰糖蛋白。(4) FNDC5的N-连接糖基化修饰对irisin分泌影响的研究为探索FNDC5的N-连接糖基化修饰与irisin分泌的关系,本研究使用NetNGlyc1.0 Server程序分析FNDC5的N-连接糖基化修饰位点。根据分析结果,构建FNDC5的N-连接糖基化修饰位点点突变载体,转染HeLa细胞观察融合蛋白的亚细胞定位。使用GFP抗体分别对糖基化修饰位点点突变的融合蛋白进行Western blotting检测。亚细胞定位结果表明：第36位氨基酸突变的FNDC5融合蛋白在内质网滞留,第81位氨基酸突变的FNDC5融合蛋白的亚细胞定位与野生型FNDC5融合蛋白相同。Western blotting检测结果表明：与野生型的FNDC5融合蛋白相比,第36或81位氨基酸突变的FNDC5融合蛋白的相对分子量均减小。经糖苷酶PNGase F酶切,野生型的FNDC5融合蛋白和第36或81位氨基酸突变的FNDC5融合蛋白的相对分子量均降至51 kDa。因此FNDC5第36和81位氨基酸均为FNDC5蛋白N-连接糖基化修饰位点。FNDC5第36位氨基酸的N-连接糖基化修饰是FNDC5信号肽剪切及irisin分泌的重要保障。(5)白色脂肪细胞的分离和鉴定为研究irisin对白色脂肪细胞棕色化作用机制做初步的细胞准备,本研究采用胶原酶消化法,从C57BL/6小鼠腹股沟的白色脂肪组织分离白色脂肪细胞,肩胛间的棕色脂肪组织分离棕色脂肪细胞。以棕色脂肪细胞为对照,使用细胞免疫荧光、荧光定量PCR和Western blotting对白色脂肪细胞进行鉴定。细胞免疫荧光检测结果显示白色和棕色脂肪细胞均呈解偶联蛋白1(UCP-1)阳性,白色脂肪细胞呈溶质载体家族7成员10(ASC-1)阳性,棕色脂肪细胞呈ASC-1阴性。荧光定量PCR结果表明：白色脂肪细胞中UCP-1表达量为棕色脂肪细胞的0.47倍(P<0.05),α-tubulin的表达量为棕色脂肪细胞的1.41倍(P>0.05)。Western blotting检测结果显示：白色脂肪细胞中UCP-1表达量是棕色脂肪细胞0.49倍(P<0.01),α-tubulin表达量是棕色脂肪细胞1.53倍(P>0.05),棕色脂肪细胞中未检测到ASC-1的表达。因此所分离的细胞为白色脂肪细胞,可以用于后续irisin对白色脂肪细胞影响的研究。(6)小鼠FNDC5组织表达谱的检测为了解FNDC5的组织表达,为FNDC5基因的克隆奠定基础,本研究通过荧光定量PCR和Western blotting技术检测小鼠心脏、肌肉、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、白色脂肪和棕色脂肪组织中FNDC5表达。荧光定量PCR检测结果表明：FNDC5在心脏表达量极显著高于肌肉、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、白色脂肪和棕色脂肪组织(均P<0.01)。Western blotting检测结果表明：FNDC5在心脏和肌肉组织总蛋白样品中出现特异性条带。因此FNDC5在心脏和肌肉组织中高表达。(7) FNDC5和irisin的原核表达为纯化FNDC5和irisin蛋白,本研究以心脏组织cDNA为模板,扩增FNDC5和irisin基因。将FNDC5和irisin基因与谷胱甘肽转移酶(GST)标签以C端融合的方式重组,构建重组质粒PGEX-4T-1-FNDC5和PGEX-4T-1-irisin,转化到表达菌株BL21(DE3)pLysS中,经1.0mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 37℃诱导表达后,使用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化GST-FNDC5和GST-irisin融合蛋白,并进行考马斯亮蓝染色和Western blotting检测。结果表明：IPTG可诱导GST-FNDC5和GST-irisin蛋白的表达,本研究所使用的irisin抗体能够与FNDC5和irisin发生特异结合。(8) Irisin促进白色脂肪棕色化作用机制的初步探讨为了解irisin促进白色脂肪棕色化的作用机制,本研究使用原核表达的GST-irisin (10ng/mL、100ng/mL和1μg/mL)处理白色脂肪细胞6h后,利用荧光定量PCR检测UCP-1的表达量。结果表明：与对照组0ng/mL相比,三个处理组UCP-1的表达量均有升高,10 ng/mL处理组与100ng/mL处理组和1μg/mL处理组UCP-1的表达量均有极显著差异(P<0.01)。100 ng/mL处理组与1μg/mL处理组UCP-1的表达量差异不显著(P>0.05)。因此GST-irisin最佳使用浓度为100 ng/mL o使用100 ng/mL GST-irisin处理白色脂肪细胞,利用Western blotting检测蛋白激酶p38、ERK和AKT蛋白的磷酸化水平。结果表明：100 ng/mL的GST-irisin激活蛋白激酶p38、ERK的磷酸化,不激活AKT蛋白的磷酸化。因此irisin的白色脂肪棕色化作用与p38、ERK蛋白的磷酸化有关,与AKT蛋白的磷酸化不相关。