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背景与目的阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea, OS A)是一种以睡眠中反复的上气道阻塞、通气明显减少或停止导致体内低氧为特征的较高发病率的临床疾病,可引起高血压、心肌梗塞、中风和猝死等一系列严重的相关症状和疾病。颏舌肌是最大的促使上气道开放的扩张肌,受舌下运动神经元发出的舌下神经支配。当其收缩时使舌肌向前运动,促使咽部气道开放,从而保证了肺的有效通气,是呼吸正常进行的前提。研究表明,OSA的发病机制与睡眠期,尤其是快眼动(rapid eye movement, REM)睡眠期颏舌肌肌张力的抑制有关。对于气道解剖结构已狭窄的OSA病人,REM期颏舌肌肌张力的下降,引起舌肌向口咽腔方向后坠,导致严重的上气道阻塞,引起睡眠期反复的低氧血症。但目前对其病因、发病机制等并没有完全阐明。研究显示OSA患者血浆中orexin A的浓度显著低于正常人。而orexin基因敲除小鼠在REM睡眠期会频繁地出现睡眠呼吸暂停。这些实验结果都提示OSA与orexin的调控异常有关。Orexins(包括orexin A和orexin B)是下丘脑orexin神经元分泌的一种神经肽,在体内很多生理过程中发挥重要的作用,如摄食和能量稳态、睡眠觉醒周期、应激、心血管呼吸的调节等等。Orexin受体(orexin receptor, OXR)属于G蛋白耦联受体家族,主要分为两种亚型——orexin-1型受体(orexin type 1 receptor, OX1R)和orexin-2型受体(orexin type 2 receptor, OX2R).其中orexinA可以和两种受体结合,orexin B主要和OX2R结合。形态学研究表明,舌下运动神经元不仅接受orexin纤维的投射,还表达OX1R和OX2R。然而,到目前为止还不清楚orexin对上气道开放是如何调控的。关于orexin对颏舌肌和舌下神经活动的调节作用,至今研究甚少。在去大脑猫的舌下神经核微量注射orexin A可增强颏舌肌的活动。在大鼠脑桥KF核微量注射orexin B可延长舌下神经的放电时间。但这些仅有的结果并未探讨内源性orexin对颏舌肌的作用及其作用的机制,以及orexin在不同睡眠觉醒状态下是如何通过作用于舌下运动神经元来增强颏舌肌的活动。所以,本实验主要探讨内源性orexin是如何调节颏舌肌和舌下神经的活动及其作用的受体机制,另外在清醒自由运动动物的不同睡眠觉醒状态观察内源性orexin对颏舌肌活动的作用,并且通过建立慢性间歇性低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)模型大鼠模拟临床OSA,观察CIH模型大鼠颏舌肌和舌下神经活动的变化,探讨下丘脑外侧区(lateral hypothalamus, LH) orexin神经元和延髓舌下神经核OXR在OSA病理过程中的作用机制,希望为OSA的发病机制及其临床治疗提供新的理论依据。材料与方法实验采用健康成年雄性SD大鼠。1. 正常大鼠麻醉后在延髓一侧舌下神经核进行微量注射,同时记录同侧颏舌肌的肌电活动,观察不同浓度的外源性orexin A、不同的OXR特异性拮抗剂对颏舌肌肌电的作用；2.预先用特异性神经毁损药物orexin-SAP毁损大鼠双侧LH区orexin神经元或双侧延髓舌下神经核区的舌下运动神经元,14天后麻醉动物记录颏舌肌肌电和舌下神经放电活动,观察内源性orexin对颏舌肌肌电和舌下神经放电的作用；3.预先用orexin-SAP毁损大鼠双侧LH区orexin神经元,14天后记录清醒自由运动动物的脑电、颈部肌电和颏舌肌肌电活动,观察不同睡眠觉醒状态下内源性orexin对颏舌肌肌电的作用；4.建立CIH模型大鼠,记录颏舌肌肌电和舌下神经放电活动的变化,并观察LH区orexin神经元和延髓舌下神经核OXR的表达变化。结果用“均数±标准误”表示,多样本均数比较采用单因素的方差分析,再用Newman-Keuls检验,两样本均数比较采用配对设计的t检验,或成组设计的t检验,P<0.05时认为有统计学意义。结果1.外源性orexin A对正常大鼠麻醉状态下颏舌肌肌电的作用：正常大鼠延髓舌下神经核微量注射外源性orexin A (0.1 μ1)后主要引起颏舌肌的呼吸相关性活动增强。50μmol/l (n=6, P<0.05)、100μmol/l (n=5, P<0.05)、 200μmol/l (n=5, P<0.05) orexin A均使颏舌肌的呼吸相关性活动明显增加,但呼吸频率均无变化(P>0.05)。其中200μ.mol/l orexin A对颏舌肌呼吸相关性活动的作用比50 μmol/l orexin A显著增大(P<0.05)。2.内源性orexin对正常大鼠麻醉状态下颏舌肌肌电和舌下神经放电的作用：2.1预先用特异性神经毁损药物orexin-SAP (0.43mg/ml,400nl/侧)毁损双侧LH区orexin神经元,颏舌肌的呼吸相关性活动减小(n=6,P<0.001),舌下神经的呼吸相关性活动也明显减小(n=5,P<0.001)。2.2预先用orexin-SAP (0.43mg/ml,200nl/侧)毁损双侧舌下运动神经元,颏舌肌的呼吸相关性活动明显减小(n=4,P<0.001),舌下神经的呼吸相关性活动也显著减小(n=3,P<0.001)。3.内源性orexin对正常大鼠不同睡眠觉醒状态下颏舌肌肌电的作用：双侧LH区orexin神经元毁损的大鼠无论在白天还是黑夜,其慢波睡眠(slowwave sleep, SWS)期的颏舌肌肌电明显减弱(n=4,P<0.01),而清醒(wakefulness,W)期、REM睡眠期颏舌肌肌电有减小趋势,但无统计学意义(n=4,P>0.05)。4. Orexin对颏舌肌作用的受体机制：4.1 OX1R的作用：在正常大鼠延髓舌下神经核微量注射特异性OX1R拮抗剂SB334867(10mmol/l,0.1μl)后,颏舌肌的呼吸相关性活动明显减弱(n=4,P<0.01)；4.2 OX2R的作用：正常大鼠延髓舌下神经核微量注射特异性OX2R拮抗剂TCS OX229 (1 mmol/1,0.1 μl)使颏舌肌的呼吸相关性活动显著减弱(n=5,P<0.01),同时使颏舌肌的紧张性活动也明显减弱(n=5,P<0.05)。5. Orexin对CIH模型大鼠呼吸活动的影响：5.1CIH模型大鼠颏舌肌肌电和舌下神经放电的变化：CIH模型大鼠颏舌肌紧张性活动减弱(n=6,P<0.001),呼吸相关性活动也减弱(n=6,P<0.05)；舌下神经的呼吸相关性活动也明显减弱(n=7,P<0.05)。5.2 CIH模型大鼠LH区orexin神经元和延髓舌下神经核OXR表达的变化：CIH模型大鼠LH区orexin神经元相对光密度值减小(n=6,P<0.05)。延髓舌下神经核OX1R相对光密度值减少(n=6),OX2R相对光密度值增多(n=6),但两者均无统计学意义。结论1.内源性和外源性orexin A均可增强颏舌肌和舌下神经的活动；2.延髓舌下运动神经元的OX1R和OX2R均介导了LH区orexin神经元对颏舌肌的兴奋作用；3.内源性orexin能够在慢波睡眠期增强颏舌肌的活动；4.CIH模型大鼠的颏舌肌和舌下神经活动均减弱,可能和LH区orexin神经元的表达减少有关。