[研究背景和目的]上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC) (以下简称卵巢癌)是妇科最常见的恶性肿瘤,具有死亡率高、预后差等特点,且五年生存率不到30%。卵巢癌血管丰富,肿瘤增长速度快,恶性程度高是其生物学特点。目前,抗肿瘤血管生成治疗已引入卵巢癌的常规治疗,主要包括2种药物(重组人血管内皮抑素、贝伐珠单抗),且取得了较好疗效。但面对卵巢癌当前的严峻形势,继续寻找合理有效的靶点,研发新药仍是提高卵巢癌患者生存率,延长其生存期的关键。传统上认为,自然杀伤细胞(nature killer cell, NK)的特点就在于它不需要肿瘤特异性抗原的识别,可直接杀伤肿瘤细胞,因而其在抗肿瘤免疫治疗中具有重要地位[1-3]。然而,有研究[4]报道显示,根据NK细胞膜表面CD56分子表达水平的不同,可将其分为两类：(1)CD56dimCD16bright,占NK细胞的90%左右,其主要功能是细胞毒性作用；(2)CD56brightCD16dim,占NK细胞5-10%,这类NK细胞的主要功能是促进血管生成,它能分泌VEGF、PIGF、IL-8等促血管生成细胞因子,并通过这些因子发挥其促进肿瘤血管生成的作用。尤其在胎盘的生长过程中,表型为CD56SuperbrightCD16dim,其促血管生成作用更为明显,故又被称为胎盘NK细胞Decidual natural killer cells, dNK)。因此,本研究的目的是验证卵巢癌浸润NK细胞与肿瘤血管生成的相关性,为卵巢癌的治疗提供新思路。[方法]1.选取并收集2015年1月至2016年1月于昆明医科大学第三附属医院(云南省肿瘤医院)妇瘤科就诊,未接受辅助治疗、经手术切除并经病理证实的上皮性卵巢癌标本31例,采集临床资料(包括年龄、组织病理分型、组织分级、临床分期、有无淋巴结转移)。另取因其他疾病(主要为宫颈癌)手术切除的正常卵巢组织30例作为对照,选取原则为组织病理学确诊卵巢组织未受累。采用流式细胞仪对卵巢癌和正常卵巢组织中CD56brightCD16dimNK细胞进行检测,免疫荧光法检测VEGF、MVD及α-SMA表达水平,从而分析CD56brightCD16dimNK细胞与VEGF、MVD、α-SMA在上皮性卵巢癌临床病理特征问的关系及其之间的相关性,探索它们在卵巢癌发生、发展过程中的作用,并探讨CD56brightCD16dimNK细胞与肿瘤血管生成的关系。2.选取人卵巢癌细胞系SKOV3细胞,建立小鼠卵巢癌荷瘤模型,分为3组,分别用生理盐水(0.2m1/只)、重组人血管内皮抑素(3mg/kg,1次/日)、贝伐珠单抗(5mg/kg,2次/周)处理,2周后每只小鼠取癌组织、癌旁组织、癌周组织3个样本,采用流式细胞仪检测NK1.1+细胞,免疫荧光技术检测、EGF、MVD及α-SMA表达水平,分析卵巢癌浸润NK细胞与肿瘤血管生成的关系,并初步探讨重组人血管内皮抑素、贝伐珠单抗抗肿瘤血管生成的相关机制。3.统计方法：实验数据采用SPSS 17.0软件包进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x士s)表示,采用Kolmogorov-Smirnov检验行正态分布检验,采用Levene检验行方差齐性检验。多组样本比较采用单因素方差分析、x2检验或Fisher确切概率法,两组样本比较采用独立样本t检验或t’检验。参数间相关性分析采用Pearson检验。以α=0.05(双侧)作为检验水准,P<0.05定为有统计学意义。[结果]1.正常卵巢和卵巢癌组织中VEGF、MVD、α-SMA的表达1) VEGF在正常卵巢和卵巢癌组织中的表达VEGF主要定位于细胞浆或细胞膜,呈红色荧光颗粒。VEGF在上皮性卵巢癌组织的阳性表达率为87.1%(27/31),正常卵巢组织的阳性表达率为23.33%(7/23),卵巢癌组织中VEGF表达强度明显高于正常卵巢组织,差异具有统计学意义(P=0.000)。VEGF在上皮性卵巢癌组织中的表达与患者的年龄、卵巢癌病理分型、组织分级、临床分期、淋巴结转移无关。2)α-SMA在正常卵巢和卵巢癌组织中的表达α-SMA主要定位在间质细胞质,呈红色荧光颗粒。α-SMA在上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率为74.19%(23/31),正常卵巢组织的阳性率为26.7%(8/30),卵巢癌组织中α-SMA强度明显高于正常卵巢组织,差异具有统计学意义(P=0.000)。卵巢癌组织中α-SMA阳性表达率与患者的年龄、卵巢癌病理分型、临床分期、组织分级及淋巴结转移无关。3)MVD在正常卵巢和卵巢癌组织中的表达MVD主要定位在细胞质,呈现绿色荧光颗粒。上皮性卵巢癌组织MVD值为21.95±3.37,正常卵巢组织MVD值为8.82±1.38,差异具有统计学意义(P=0.000),并且卵巢癌组织中MVD值明显高于正常卵巢组织。卵巢癌组织MVD值与患者的年龄、卵巢癌病理分型、临床分期及淋巴结转移无关,而与组织分级有关。低分化组织中MVD值最高,高分化组织中MVD值第二,中分化组织中MVD值最低,中分化与高、低分化之间有差异,高、低分化之间MVD值无差异。2.CD56brightCD16dimNK细胞在正常卵巢和卵巢癌组织中占淋巴细胞的比率上皮性卵巢癌组织CD56brightCD16dimNK细胞比率为(71.88+11.76)%,正常卵巢组织CD56brightCD16dimNK细胞比率为(19.22+11.64)%,两组差异具有统计学意义(P<0.001),并且在卵巢癌组织中CD56brightCD16dimNK细胞比率明显高于正常卵巢组织。卵巢癌患者CD56bright16dimNK细胞比率与淋巴结转移、临床分期有关,有淋巴结转移、临床分期为I、II期的CD56bright16dimNK细胞比率小于无淋巴结转移、临床分期为Ⅲ, Ⅳ期组,而与年龄、组织分级、病理分型无关。CD56bright16dimNK细胞和MVD在上皮性卵巢癌中的表达具有相关性(r=0.621,P=0.022),并且其二者之间呈正相关关系。3.人卵巢癌荷瘤鼠中NK1.1+细胞占淋巴细胞比率生理盐水组癌组织NK1.1+细胞比率为(4.34±1.56)%,重组人血管内皮抑素组癌组NK1.1+细胞比率为(6.22±0.29)%,贝伐珠单抗组癌组织NK1.1+表达为(6.08±1.45)%,3组进行比较,生理盐水组与贝伐珠单抗、重组人血管内皮抑素组癌组均有差异(P=0.028、0.036),贝伐珠单抗与重组人血管内皮抑素组无差异(P=0.883)。相比较生理盐水组,贝伐珠单抗组和重组人血管内皮抑素组的NK1.1+细胞数明显增多。[结论]1.卵巢癌组织中CD56bright16dimNK细胞占淋巴淋巴比率明显高于正常卵巢组织。卵巢癌组织CD56bright16dimNK细胞比率与淋巴结转移、临床分期有关,而与年龄、组织分级、病理分型无关。2. CD56bright16dimNK细胞和MVD在上皮性卵巢癌中的表达具有相关性,并且呈正相关关系。CD56bright16dimNK细胞与肿瘤血管生成有相关性,可能成为卵巢癌生物学治疗的新靶点。3.贝伐珠单抗和重组人血管内皮抑素能增加NK1.1+细胞占淋巴细胞比率。