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研究背景和目的一氧化氮(NO)是一种性质活跃的气体信号分子,发挥血管舒张、突触传递及免疫防御等多种生理功能。目前的研究还发现NO与肿瘤关系密切,调控肿瘤的起始、转移、耐药和免疫逃逸等一系列过程。内源性的NO主要由三种一氧化氮合酶(NOS)催化生成。其中NOS1和NOS3为组成型表达,合成低浓度的NO;而NOS2为诱导性型表达,合成高浓度的NO。不同的NOS产生NO的浓度及持续时间不同,决定了其生物学效应的不同。近年来越来越多的研究表明,不同NOS的亚细胞定位也是决定其功能的重要因素之一。目前发现不同的NOS亚型可以定位于细胞膜、溶酶体、高尔基体及细胞核等不同的亚细胞结构中。既往已经有研究显示NO参与了结肠癌发生、发展及转移等一系列过程,但NOS1在结肠癌发生发展中的作用目前尚未见报道。本研究的主要目的是探讨NOS1是否通过其特殊的亚细胞定位参与结肠癌的进展。研究结果1.NOS1定位于结肠癌细胞线粒体:分析TCGA数据库显示NOS1表达量与结直肠腺癌患者的临床分期呈负相关,并且NOS1高表达提示预后较差。为了深入研究NOS1对结肠癌的影响,我们构建了稳定过表达NOS1的结肠癌细胞株。应用差速离心法提取线粒体,结果显示过表达的NOS1蛋白在线粒体内表达。荧光共聚焦显微镜也显示NOS1蛋白与线粒体有共定位的关系。最后我们发现NOS1增加线粒体内NO含量。2.线粒体NOS1通过增加SIRT3酶活性诱导结肠癌化疗耐药:首先我们发现NOS1抑制基础状态及顺铂处理后线粒体超氧阴离子(O2-)水平;并且抑制顺铂诱导的线粒体膜电位下降、细胞色素C释放及细胞凋亡。进一步实验结果显示这种抑制效应与NOS1诱导的SIRT3酶活性增加和SOD2的低乙酰化修饰有关。敲低SIRT3后,NOS1导致线粒体活性氧抑制和化疗耐药均被逆转。裸鼠皮下成瘤实验显示NOS1增加结肠癌的成瘤能力与化疗耐药。3.HSP90协助NOS1向线粒体内的转移:HSP90的C端抑制剂sylibum抑制HSP90与NOS1的结合,并阻止NOS1向线粒体内转移,sylibum逆转NOS1诱导的化疗耐药。4.线粒体NOS1通过增加过氧化氢(H2O2)抑制结肠癌细胞I型干扰素通路:流式细胞术显示NOS1抑制IFN α诱导的结肠癌细胞STAT1磷酸化水平(IFN β-p-STAT1);进一步实验发现NOS1增加过氧化氢的生成;而过氧化氢酶能够逆转NOS1对IFN α-p-STAT1的抑制;最后RNA-seq转录组测序结果显示NOS1抑制IFNβ诱导的下游基因(ISGs)表达。研究结论结肠癌中NOS1在HSP90的协助下转移至线粒体内。一方面,线粒体NOS1通过mtNOS1-SIRT3-SOD2途径增强线粒体抗氧化应激能力,导致结肠癌的化疗耐药,敲低SIRT3或者HSP90抑制剂,能逆转NOS1诱导的化疗耐药。另一方面,线粒体NOS1促进线粒体O2转化为H202,H2O2由线粒体释放入胞浆,诱导结肠癌细胞I型干扰素通路障碍。本研究为靶向NOS1逆转结肠癌化疗耐药提供了理论依据,但是NOS1抑制I型干扰素通路对结肠癌免疫耐受的影响还有待在体内实验中进一步探讨。