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CD4+CD25+调节性T(Treg)细胞是由胸腺产生的特异性T细胞亚群,在维持机体外周免疫耐受中发挥中重要作用,CD4+CD25+Treg细胞的缺失或者功能下调可以导致多种自身免疫性疾病的发生。CD4+CD25+Treg细胞特异性地表达Foxp3,若Foxp3表达缺失,自身反应性T细胞克隆将变得活跃并导致多种严重自身免疫性疾病的发生。
实验性自身免疫性葡萄膜炎(Experimental Autoimmune Uveoretinitis,EAU)是一种器官特异性的自身免疫性疾病,也是研究人类葡萄膜炎的一个经典动物模型。尽管EAU与人类葡萄膜炎在病理改变上极其相似,但两者在病程上有显著的区别,EAU的炎症表现为单向性、自愈性,而人类葡萄膜炎则多表现为慢性、复发性。大量研究证明Th1和Th17两群效应性T细胞在EAU和人类葡萄膜炎的发病过程中起重要作用。CD4+CD25+Treg细胞可能通过调节这两群效应性T细胞参与EAU的发生、发展以及转归。
在EAU发病过程中,CD4+CD25+Treg细胞的作用及其与效应性T细胞的关系尚未见报道。本课题旨在探讨CD4+CD25+Treg细胞在EAU发病中数量和功能的变化,以及其与EAU发生、发展和转归的关系,实验结果显示CD4+CD25+Treg细胞在EAU发病过程中呈现数量增高且功能增强,提示CD4+CD25+Treg细胞在EAU的恢复期发挥重要作用。
本课题的研究主要分为以下五个部分:
第一部分、建立EAU模型
目的:观察EAU炎症的发生、发展和转归以及眼局部病理改变。
方法:将光感受器维生素A类结合蛋白161-180(interphotoreceptor retinoid-bindingprotein,IRBP161-180)50μg与完全弗氏佐剂(Complete Freunds adjuvant,CFA)150μl完全充分混合,于B10RⅢ小鼠皮下注射。百日咳毒素(Pertussis toxin,PTX)1.0μg腹腔注射。将50μl PBS与150μl CFA完全充分混合后皮下注射的小鼠作为对照组。自建立EAU模型7天后开始隔日进行临床观察,自建立EAU模型后8天、14天、21天、28天行眼底病理切片观察。
结果:临床和病理观察结果显示,自EAU模型建立起8-9天开始出现炎症,在第14天时炎症达到高峰期,随后炎症迅速消退。在建立EAU模型后的28天,炎症全部消退。炎症主要表现为前房细胞、前房闪辉、前房渗出、视网膜以及脉络膜的严重损害。对照组则无炎症改变。
结论:与对照组相比,EAU模型炎症明显。
第二部分、EAU小鼠CD4+CD25+Treg细胞表达水平变化的研究
目的:检测EAU小鼠发病过程中脾脏和淋巴结CD4+CD25+Treg细胞的表达。
方法:建立EAU模型后的0、7、14、21和28天,分离脾细胞,利用RT-PCR(reversetranscriptase polymerase chain reaction)检测Foxp3 mRNA表达水平。在上述时间点分离脾细胞和引流淋巴结淋巴细胞,使用流式细胞术(FCM)检测表达Foxp3的CD4+CD25+Treg细胞比例的变化。
结果:与正常小鼠相比,RT-PCR结果显示,在建立模型后的第7天Foxp3表达增高(p=0.001),14天时达到高峰(p<0.001),后一直维持在较高的水平直至检测的免疫后28天。FCM结果显示脾脏CD4+Foxp3+T细胞的比例在第7天时开始增高(13.57%,p<0.001),14天时达到高峰(19.73,p<0.001),后维持在一个较高的水平(21天16.85%,p<0.001;28天17.96%,p<0.001;42天17.41%,p<0.001)。脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞频率变化与CD4+Foxp3+T细胞的频率变化趋势基本一致,即免疫后7天开始增高,14天达到高峰,后一直维持在较高的水平,直至检测到的免疫后42天。淋巴结CD4+Foxp3+T细胞和CD4+CD25+Foxp3+T细胞频率变化与脾脏这两群细胞的频率变化趋势一致。
结论:在EAU炎症发生发展过程中,Foxp3的表达和CD4+CD25+Treg细胞频率的变化与炎症的发展密切相关。
第三部分、EAU小鼠CD4+CD25+Treg细胞增殖抑制功能变化的研究
目的:检测EAU小鼠CD4+CD25+Treg细胞对CD4+CD25-T细胞增殖的抑制功能。
方法:分离14天和28天EAU小鼠和对照组小鼠引流淋巴结淋巴细胞,采用免疫磁珠细胞分离法(MACS)分选出CD4+CD25+Treg细胞和CD4+CD25-T细胞。取注射巯基乙酸盐小鼠腹腔渗出细胞作为抗原递呈细胞(APCs)。在APCs和可溶性1μg/ml anti-CD3存在条件下,EAU小鼠CD4+CD25-T细胞以不同比例与自体CD4+CD25+Treg细胞共同培养或以1∶1比例与对照组小鼠CD4+CD25+Treg细胞共同培养,共计培养72小时后加入10μl WST-8,再培养4小时,采用酶标仪读数检测细胞增殖。
结果:EAU小鼠和对照组小鼠CD4+CD25+Treg细胞在多克隆刺激下无明显增殖。炎症期和恢复期EAU小鼠CD4+CD25+Treg细胞对CD4+CD25-T细胞抑制功能显著强于对照组小鼠。
结论:EAU炎症期、恢复期和对照组小鼠CD4+CD25+Treg细胞均具有无能和抑制特征。炎症期和恢复期EAU小鼠CD4+CD25+Treg细胞的抑制增殖功能显著上调,可能与EAU疾病的恢复关系密切。
第四部分、EAU小鼠CD4+CD25+Treg细胞
对细胞因子分泌抑制功能变化的研究
目的:检测EAU小鼠CD4+CD25+Treg细胞对CD4+CD25-T细胞产生细胞因子的抑制功能。
方法:取14天和28天EAU小鼠以及对照组小鼠引流淋巴结,分离淋巴细胞。CD4+CD25+Treg细胞、CD4+CD25-T细胞和APCs的分选和处理如前所述。在可溶性的1μg/ml anti-CD3和APCs存在的条件下,EAU小鼠或对照组小鼠CD4+CD25-T细胞分别以1∶1比例与对照组小鼠或EAU小鼠CD4+CD25+Treg细胞共同培养。在培养3天时,移取上清,用ELISA方法检测上清中IFN-γ和IL-17水平。
结果:炎症期EAU小鼠CD4+CD25-T细胞培养上清中IFN-γ的水平(255.5±48.5pg/ml)显著高于对照组小鼠(143.1±24.7pg/ml p<0.001),恢复期小鼠CD4+CD25-T细胞培养上清中IFN-γ的水平(107.3±34.5pg/ml)显著低于对照组小鼠(p=0.032)。炎症期和恢复期EAU小鼠CD4+CD25-T细胞与CD4+CD25+Treg细胞共同培养上清中IFNˉγ的水平显著低于对照组小鼠(炎症期35.8±4.5pg/ml p<0.001;恢复期50.2±11.8pg/ml p=0.003;对照组75.8±16.1pg/ml)。炎症期和恢复期EAU小鼠CD4+CD25-T细胞培养上清中IL-17的水平显著高于对照组小鼠(炎症期1949.0±576.8pg/ml p<0.001;恢复期549.0±187.5pg/ml p<0.001;对照组216.4±68.5pg/ml),EAU炎症期、恢复期和对照组小鼠CD4+CD25+Treg细胞对CD4+CD25-T细胞分泌IL-17无显著抑制和促进作用。
结论:炎症期和恢复期EAU小鼠CD4+CD25+Treg细胞对IFN-γ的分泌强于对照组小鼠CD4+CD25+Treg细胞,而对上调的IL-17无显著抑制或促进作用。
第五部分过继转移CD4+CD25+Treg细胞对EAU影响的研究
目的:探讨过继转移CD4+CD25+Treg细胞对EAU发病的影响。
方法:取14天和28天EAU小鼠和对照组小鼠引流淋巴结,分离淋巴细胞。采用MACS法分选出CD4+CD25+Treg细胞,通过鼠尾静脉注射到正常小鼠体内,同时建立EAU模型。建立EAU模型后14天,病理切片观察炎症的严重程度。
结果:过继转移炎症期和恢复期EAU小鼠CD4+CD25+Treg细胞可以显著抑制EAU的严重程度(炎症期1.3±0.3 p=0.001;恢复期1.5±0.6 p=0.027),过继转移对照组小鼠CD4+CD25+Treg细胞虽然可以轻度抑制炎症的严重程度,但并无统计学意义(2.4±0.5 p=0.235)。
结论:通过体内实验进一步证明炎症期和恢复期EAU小鼠CD4+CD25+Treg抑制功能增强,可能参与抑制炎症活动,加速了EAU的恢复。
全文总结:本研究中CD4+CD25+Treg细胞表达和抑制功能在炎症期和恢复期EAU小鼠体内显著上调的结果表明CD4+CD25+Treg细胞数量增加和功能增强可能加速EAU炎症的迅速恢复。