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马度米星铵是聚醚类离子载体抗生素中的一种,其被畜禽养殖业广泛应用于防治鸡球虫病。但是马度米星铵的安全使用剂量范围较窄,中毒剂量与推荐使用剂量相近,且毒性较大,在使用时若药物拌料不均匀很容易导致鸡只的中毒,在实际应用过程中也确实发生了多起由马度米星铵引起的动物中毒事件。另一方面,马度米星铵在进入鸡体内后并不会被完全代谢,部分会通过排泄物以中间代谢物的方式进入环境。当残留有马度米星铵的畜禽粪肥被用作农田土壤的肥料时,马度米星铵可能会被引入土壤及水体环境中,对水生生物例如鱼类、藻类等造成潜在威胁。为研究及评价马度米星铵的环境毒性,本研究以斑马鱼作为试验对象,探究马度米星铵对斑马鱼造成的毒性威胁,研究其在斑马鱼上的毒性作用及作用机制,具体包括以下部分:1 马度米星铵对斑马鱼的急性毒性研究基于预试验结果,利用改良寇氏法(Kaber)设计急性毒性正式试验,将斑马鱼随机暴露于10.00、11.89、14.14、16.81、20.00 mg·L-1马度米星铵溶液中,同时设置空白对照组和溶剂对照组。试验采用半静态染毒法,持续处理96h并监测受试鱼的中毒及死亡情况,得到该药物的半数致死剂量(96 hLC50)及95%置信区间。收集各组水样,用高效液相色谱法检测样品中马度米星铵的浓度。结果显示:马度米星铵组的斑马鱼在处理后的3~6 h内出现急性中毒症状,包括不规则游动、鱼体翻转等,部分死亡斑马鱼的腹部朝上,鱼鳃边缘处有白色絮状物质;马度米星铵引起斑马鱼死亡的96 h LC50为13.33 mg·L-1,95%可信限为12.64~14.05 mg·L-1;采集的不同组水样样品中马度米星铵的实测浓度值与其相应的理论浓度值之间的偏差均小于20%。结果表明:马度米星铵先溶于有机溶剂再分散于水中的染毒方式是合理可靠的;马度米星铵短时间处理斑马鱼后可引起明显的急性中毒症状及致死效应;根据《水和废水监测分析》中对于鱼类急性毒性大小的分级标准划分,判断马度米星铵对斑马鱼具有中等毒性。2马度米星铵对斑马鱼的遗传毒性研究分别用0.1、0.5和2.5 mg·L-1马度米星铵处理斑马鱼14天,从各组中分别取6条斑马鱼,解剖取肝脏,制备肝细胞悬液,利用单细胞凝胶电泳法检测肝细胞DNA的受损伤程度。各组另取4条鱼,断尾取血,制作血涂片,检测微核率。结果发现:对照组中斑马鱼肝细胞DNA的彗星图像呈圆形,马度米星铵组中斑马鱼肝细胞DNA的彗星图像出现“彗星尾巴”,随着剂量的升高,彗星尾部DNA所占比例逐渐增加;马度米星铵组中斑马鱼外周血细胞中出现微核,微核细胞数目及所占比例极显著高于对照组。结果表明:马度米星铵可对斑马鱼肝细胞DNA造成明显损伤,同时可导致斑马鱼外周血细胞出现染色体畸变;马度米星铵对斑马鱼具有强烈的遗传毒性作用。3马度米星铵对斑马鱼器官组织学结构和抗氧化系统的作用研究分别用0.1、0.5和2.5 mg·L-1马度米星铵持续处理斑马鱼14天,14天后,从各组取出4条斑马鱼,取鳃、肝、肠作石蜡切片,HE染色后在光镜下观察组织结构变化。另外,在处理后的第3、6、9和14天分别从各组取出6条斑马鱼,取肝脏及鳃,测定抗氧化酶活性及MDA含量,借助荧光定量PCR法测定两种组织中氧化应激相关基因(sod1、cat、gpx1a、gstr、nrf2、keap1)的mRNA相对表达量。结果显示:2.5 mg·L-1马度米星铵处理斑马鱼14天后,可造成斑马鱼的多个器官出现组织结构损伤,包括鳃的鳃小片层状融合、肝脏细胞的空泡化以及肠绒毛断裂等;相比对照组,0.1 mg·L-1马度米星铵组中斑马鱼肝脏在第3天时的SOD、CAT、GPX、GST等酶的活性出现显著升高,2.5 mg·L-1马度米星铵组中斑马鱼肝脏中各抗氧化酶的活性表现为显著降低;经马度米星铵处理14天后的斑马鱼肝脏中MDA含量相比对照组表现显著升高,而斑马鱼鳃中MDA含量在接受马度米星铵处理仅3天后即出现显著升高;在马度米星铵处理下,其肝脏中氧化应激相关基因的表达水平相比对照组先显示显著上调后表现为显著下调,而斑马鱼鳃中相关基因的表达水平在整个14天内多呈现显著下调趋势。结果表明:2.5 mg·L-1马度米星铵可对斑马鱼的肝、鳃、肠等重要器官造成严重的组织损伤,亚致死剂量的马度米星铵可诱导斑马鱼肝脏和鳃中产生氧化应激反应,可能对斑马鱼造成氧化损伤。4马度米星铵对斑马鱼肝脏中免疫反应和细胞凋亡相关基因表达量的影响研究分别用0.1、0.5和2.5 mg·L-1马度米星铵持续处理斑马鱼14天,在处理后的第3、6、9和14天分别从各组取出6条斑马鱼,解剖取肝脏,借助荧光定量PCR测定肝脏中与免疫反应有关的基因(il-1β、il-8、il-10、lyz、c3)及与细胞凋亡有关的基因(p53、caspase-3、caspase-8、caspase-9、bax、bcl-2、apaf-1)的mRNA相对表达量。结果发现:分别处理3、6天后,马度米星铵组的斑马鱼肝中il-1β、il-10、il-8和lyz的mRNA相对表达量均极显著高于对照组;经马度米星铵处理3、6天后,0.5及2.5 mg·L-1马度米星铵组的斑马鱼肝中p53、caspase-3、caspase-8、bax等基因的表达量相比对照组出现极显著上调;结果表明:2.5 mg·L-1马度米星铵在暴露初期可明显上调斑马鱼肝脏中炎症免疫反应及细胞凋亡相关基因的mRNA表达水平,马度米星铵可能通过诱导斑马鱼肝脏中的炎症免疫反应及细胞凋亡对肝脏造成损伤。