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各种慢性肝脏疾病会导致肝纤维化。而肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSC）的激活是形成肝纤维化的主要原因。自噬可以通过促进HSC的活化而参与肝纤维化的形成。HSC的活化需要特定信号通路的参与,其中Hedgehog信号通路发挥着重要作用。目前关于自噬与Hedgehog信号通路在HSC中的关系尚不明确。有研究发现在人的胃腺癌中随着自噬表达的增加,Hedgehog信号通路中Gli2表达也增加。因此,我们猜测:在肝纤维化疾病中,自噬是否可以通过调节Hedgehog信号通路而促进HSC的活化和肝纤维化的形成。通过对这一科学问题的解决,进一步了解HSC活化之谜,为肝纤维化的治疗提供新的思路。目的研究在CCl4诱导的小鼠肝纤维化发展中自噬的发生情况;探讨自噬在原代小鼠HSC（mice hepatic stellate cell,M-HSC）中对Hedgehog信号通路的影响。方法1、将32只雄性C57BL/6J小鼠,随机分为空白组、CCl4 2w组、CCl4 3w组、CCl4 4w组。空白组按4ml/kg剂量予以腹腔注射橄榄油,CCl4组按4ml/kg剂量予以腹腔注射CCl4与橄榄油（1:3比例）混合物,2次/周,复制小鼠肝纤维化模型。分别于造模第2周、3周、4周末收集小鼠肝脏和血清。计算小鼠的肝脏指数,试剂盒检测ALT和AST的含量,HE、Masson以及天狼星红染色观察小鼠肝脏病理组织变化,通过Western-blot检测自噬中LC3、p62蛋白,并通过Image J软件进行图像灰度分析。2、通过密度梯度离心法提取原代M-HSC,鉴定其纯度和活性。提取后的第二天,分别通过相差显微镜和油红O染色进行脂滴的鉴定;并于提取后第二天和第七天,通过免疫荧光对原代M-HSC进行α-平滑肌肌动蛋白（a-smooth muscle actin,α-SMA）、vimentin的鉴定。TGF-β1刺激M-HSC 0h、6h、12h、24h,Western-blot检测α-SMA、LC3和p62的表达;将细胞随机分为空白组、TGF-β1组、TGF-β1+雷帕霉素组、TGF-β1+3-MA组,通过Western-blot、免疫荧光和RT-PCR检测Hedgehog信号通路中Gli1、Gli2的表达。结果1、小鼠肝脏大体标本显示,空白组小鼠肝脏质地柔软,表面光滑;腹腔注射CCl4混合物后,肝脏表面变粗糙,边缘变锐利,且在CCl4 4w中出现明显的颗粒感。与空白组相比,CCl4三个组中的肝脏指数、ALT和AST的值均增加,且随着腹腔注射CCl4的时间增加而加重,差异具有统计学意义（p<0.05）。肝脏病理组织染色发现,空白组小鼠肝脏无异常;CCl4 2w组中肝脏出现少量的脂肪变性以及胶原纤维的沉积;CCl4 3w组中肝脏中胶原纤维沉积增多,有小叶间隔形成;CCl44w周组中肝脏中有大量炎性细胞浸润,间隔形成增多,中央静脉和汇管区的胶原纤维沉积也增多。Western-blot检测发现,随着腹腔注射CCl4混合物时间的增加,LC3-Ⅱ表达逐渐增多,LC3-Ⅰ表达逐渐减少,LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值逐渐增大,且在CCl4 4w组中LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值最大,大于1。同时,p62随造模时间的增长表达逐渐减少。同时,Image J软件对进行图像灰度分析得到相同的结果,差异有统计学意义（p<0.05）。2、提取原代M-HSC的纯度可达到90%以上,具有良好的细胞活性。提取原代M-HSC后的第二天,相差显微镜下可以见到具有高度折光性的脂滴,为透明的圆形小颗粒,油红O染色脂滴被染成红色;免荧光染色发现无α-SMA的表达,但有少量的vimentin的表达;提取原代M-HSC后的第七天,免荧光染色发现有大量α-SMA和vimentin的表达。TGF-β1刺激原代M-HSC 0h、6h、12h、24h后,Western-blot检测发现,α-SMA随着TGF-β1刺激时间的延长,其表达逐渐增加。LC3随着TGF-β1刺激时间的延长,LC3-Ⅰ表达逐渐减少,LC3-Ⅱ表达量逐渐增加,LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值逐渐增大,且在刺激24h LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值最大,大于1。p62随着TGF-β1刺激时间的延长表达减少。加入自噬的促进剂和抑制剂后,Western-blot结果显示,相比空白组,TGF-β1组Gli1、Gli2的表达增加;相比TGF-β1组,TGF-β1+雷帕霉素组增加更明显;而TGF-β1+3-MA组抑制了Gli1、Gli2的表达,且其表达低于TGF-β1组和TGF-β1+雷帕霉素组。同时,免疫荧光与RT-PCR得到相同结果。结论1、雄性小鼠通过腹腔注射CCl4和橄榄油（1:3的比例）混合物,可以成功复制小鼠肝纤维化模型。2、在正常小鼠肝脏中较少发生自噬,而在肝纤维化发展中自噬活动增强。3、在炎性微环境下,自噬可以通过调节原代M-HSC中Hedgehog信号通路中Gli1、Gli2的表达,从而促进HSC的活化以及肝纤维化的形成。