研究背景与目的空气污染作为呼吸系统疾病的主要危险因素之一已经引起了广泛的关注。交通污染是城市空气污染的主要来源,成分复杂。短时间暴露于交通污染即可引起肺功能下降,而长期暴露与多种肺部疾病发生发展密切相关。尽管人们对此进行了大量研究,但其具体机制目前仍不清楚。交通空气污染属于混合污染,含有多种有害成分,包括颗粒物(PM)和有害气体物质,可引起毒性效应。其中,表观遗传效应日益引起研究者的高度重视。肺部疾病患者存在全基因组及特定基因甲基化改变、及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的异常表达；而另一方面,交通空气污染中的各成分均可导致全基因组的低甲基化改变、抑癌基因启动子甲基化水平升高、及乙酰基转移酶(HAT)活性的升高。因此无论从肺部疾病的角度还是从空气污染物的角度,都说明表观遗传改变在交通空气污染引起肺部疾病发生发展中发挥重要作用。关于交通空气污染的表观遗传效应研究较少,而且大多对单一污染物所致的表观遗传效应进行了研究,而并未考虑其作为混合污染物暴露时相互之间的交互作用；另外,大多用周边空气污染监测结果来估计交通污染水平,且所用生物标本多为血液,而对于交通空气污染的靶器官肺并未进行充分研究。本研究将大鼠置于不同水平的交通污染现场,利用交通污染现场自然吸入的方式连续暴露不同时间后,对大鼠血液及靶器官肺组织中DNA甲基化(LINE-1、Alu、p16、iNOS,及APC基因)及组蛋白H3K9乙酰化水平进行定量分析,探索交通空气污染暴露引起表观遗传改变的早期效应、累积效应、交互作用及剂量-反应关系。材料与方法选择城市交通繁忙的某交通遂道和交通十字路口为交通污染区,以大学校园某区域为清洁对照区。分别在春季和秋季,将Wistar大鼠随机分成交通污染重暴露组(交通遂道)、中暴露组(交通十字路口)、轻暴露组／对照组(校园),采用交通污染现场自然吸入的方式连续暴露4小时、7天、14天、及28天,同时按照我国大气质量检测标准要求,对主要交通污染进行监测。收集不同暴露时间窗口大鼠血液及靶器官肺组织,提取基因组DNA及总组蛋白。利用焦磷酸测序对全基因组甲基化(LINE-1、Alu)及特定基因启动子甲基化(p16、iNOS、及APC基因)进行定量检测,用定量ELISA试剂盒对组蛋白H3K9乙酰化水平进行定量检测。用SPSS19.0软件进行统计分析。用独立样本t检验对春秋两季资料、及同组雌雄两性大鼠资料进行比较。用单因素方差分析及post-hoc (Bonferroni检验)对各组间空气污染物水平、DNA甲基化、及组蛋白H3K9乙酰化进行比较。用多因素线性回归分析来探索空气污染物水平影响DNA甲基化和组蛋白H3K9乙酰化的剂量-反应关系和时间累积效应,用广义线性模型对季节、性别及空气污染物水平之间的交互作用进行分析。结果(1) 交通空气污染水平：隧道组及十字路口组春季及秋季PM2.5、PM10、及NO2水平均显著高于对照组(P<0.01),且隧道组交通PM2.5、PM10、及NO2水平均显著高于十字路口组(P<0.01)(2)DNA甲基化改变：大鼠血液和肺组织DNA甲基化水平均未见显著的性别差异。4小时暴露后,隧道组和十字路口组大鼠血液和肺组织LINE-1和iNOS启动子甲基化水平显著低于对照组, 且隧道组肺组织APC启动子甲基化水平显著高于对照组。7天暴露后,隧道组和十字路口组大鼠血液和肺组织LINE-1和iNOS启动子甲基化水平均显著低于对照组,隧道组大鼠血液p16启动子甲基化水平显著高于对照组,且隧道组大鼠肺组织p16和APC启动子甲基化水平均显著高于对照组。(3)组蛋白H3K9乙酰化改变：大鼠血液PBMC和肺组织组蛋白H3K9乙酰化水平均未见显著的性别差异。4小时暴露后,各组大鼠血液PBMC和肺组织组蛋白H3K9乙酰化水平未见显著改变,但暴露7天后,隧道组和十字路口组大鼠PBMC和肺组织组蛋白H3K9乙酰化水平显著高于对照组,且隧道组乙酰化水平也显著高于十字路口组。(4)交通空气污染影响DNA甲基化的剂量-反应关系：1)4小时暴露窗口中,PM2.5水平每升高1μg/m3可引起大鼠血液LINE-1甲基化降低0.027%(P=0.003), iNOS启动子甲基化降低0.037%(P=0.001),大鼠肺组织LINE-1甲基化降低0.041%(P<0.001)。PM1o水平每升高1μg/m3可引起大鼠血液LINE-1甲基化降低0.018%(P<0.001)、iNOS启动子甲基化降低0.024%(P=0.001),大鼠肺组织LINE-1甲基化降低0.027%(P<0.001)。N02水平每升高1μg/m3,大鼠血液iNOS启动子甲基化升高0.076%(P<0.05)、p16启动子甲基化水平降低0.088%(P<0.01),大鼠肺组织iNOS甲基化升高0.102%(P<0.001)。2)7天暴露窗口中,PM2.5水平每升高1μg/m3,大鼠血液LINE-1甲基化水平降低0.064%(P=0.003)、iNOS启动子甲基化水平降低0.047%(P=0.047)；肺组织LINE-1甲基化水平降低0.033%(P=0.012)、iNOS启动子甲基化水平降低0.053%(P=0.006)、APC启动子甲基化水平升高0.009%(P=0.046)。PM10水平每升高1μg/m3,大鼠血液LINE-1甲基化水平降低0.037%(P=0.003),肺组织LINE-1和iNOS启动子甲基化水平分别降低0.019%(P<0.05)和0.031%(P<0.01)。N02水平每升高1μg/m3可引起大鼠血液LINE-1甲基化水平升高0.092%(P<0.05),肺组织iNOS启动子甲基化水平升高0.099%(P<0.001)。3)对隧道中暴露不同时间(4h、7d、14d、28d)后DNA甲基化情况进行分析,结果显示,PM2.5水平每升高1μg/m3,大鼠血液p16启动子甲基化升高0.037%(P=0.001),肺组织LINE-1甲基化降低0.015%(P=0.024)、iNOS启动子甲基化降低0.058%(P<0.001)、APC启动子甲基化升高0.008%(P=0.046)、p16启动子甲基化升高0.011%(P=0.011)。PM10水平每升高1μg/m3,大鼠血液LINE-1甲基化降低0.011%(P=0.020), iNOS启动子甲基化降低0.020%(P=0.001),p16启动子甲基化升高0.019%(P=0.017)；大鼠肺组织iNOS甲基化降低0.017%(P=0.004)。N02水平升高1μg/m3可引起大鼠肺组织LINE-1甲基化降低0.067%(P<0.001)、iNOS启动子甲基化升高0.074%(P=0.006)。(5)交通空气污染影响组蛋白H3K9乙酰化的剂量-反应关系：4小时暴露窗口中,空气污染物水平每升高1μg/m3均未引起血液PBMC及肺组织组蛋白H3K9ac水平发生显著改变。7天暴露窗口中,PM2.5每升高1μg/m3, PBMC和肺组织中组蛋白H3K9乙酰化水平分别升高0.475 ng/mg蛋白(P=0.014)和0.468ng/mg蛋白(P=0.017)；PM10每升高1μg/m3, PBMC和肺组织中组蛋白H3K9乙酰化水平分别升高0.280 ng/mg蛋白(P=0.014)和0.276 ng/mg蛋白(P=0.018)。对隧道中暴露不同时间(4h、7d、14d及28d)后组蛋白H3K9乙酰化水平进行分析,结果显示PM2.5水平每升高1μg/m3,可引起PBMC和肺组织中组蛋白H3K9乙酰化水平分别升高0.638 ng/mg蛋白(P<0.001)和0.659 ng/mg蛋白(P=0.001)；PM1o水平每升高1μg/m3,可引起PBMC和肺组织中组蛋白H3K9乙酰化水平分别升高0.180 ng/mg蛋白(P=0.016)和0.189 ng/mg蛋白(P=0.023)。(6)交通空气污染影响DNA甲基化和组蛋白乙酰化的时间累积效应：随着暴露时间的延长,大鼠DNA甲基化和组蛋白H3K9乙酰化均产生显著的改变,然后趋于稳定并在暴露28天时有恢复趋势。在隧道中暴露时间每增加1天,可引起大鼠血液和肺组织LINE-1甲基化分别降低0.607%(P=0.033)和0.317%(P=0.047)；血液和肺组织iNOS启动子甲基化水平分别降低0.842%(P=0.026)和0.688%(P=0.017)；肺组织p16启动子甲基化升高0.248%(P=0.003); PBMC和肺组织组蛋白H3K9乙酰化水平分别升高16.033 ng/mg蛋白(P<0.001)和15.718ng/mg蛋白(P<0.001)。(7)季节和性别与交通空气污染的交互作用：用广义线性模型对交互作用进行分析,结果显示季节与PM2.5、PM10及NO2在影响大鼠血液LINE-1甲基化中具有交互作用；与PM10和N02在影响大鼠血液p16启动子甲基化中具有交互作用。季节与PM2.5在影响大鼠肺组织LINE-1甲基化中具有交互作用,与PM10在影响大鼠肺组织p16启动子甲基化中具有交互作用。性别与PM2.5在影响大鼠血液APC启动子甲基化和肺组织p16启动子甲基化中具有交互作用,与PM10在影响肺组织LINE-1甲基化中具有交互作用。另外,季节与PM2.5、NO2及S02在影响血液和肺组织组蛋白H3K9ac中均具有交互作用,而性别与各污染物水平在影响血液和肺组织组蛋白H3K9ac中均未见明显的交互作用。结论本研究首次将大鼠置于交通空气污染现场进行暴露,探索了交通相关空气污染引起DNA甲基化和组蛋白H3K9乙酰化的早期效应、累积效应、剂量-反应关系和交互作用,主要结论如下：1)交通空气污染暴露的早期效应主要为引起全基因组DNA低甲基化及系统性炎症相关的改变,而随着暴露时间的延长,可对特定抑癌基因甲基化水平产生显著影响。2)在一定时间内,交通相关空气污染影响DNA甲基化和组蛋白H3K9乙酰化具有明显的时间累积效应。3)季节、性别可与某些交通相关空气污染在影响DNA甲基化和组蛋白H3K9乙酰化中发生交互作用。4)APC基因甲基化改变对于反映交通空气污染引起的早期肺部改变可能具有相对较高的敏感性和特异性。以上结果显示,交通相关空气污染暴露可引起明显的表观遗传改变。尚需要大样本人群研究对本研究结果进行证实,并对环境因素在影响表观遗传改变中的交互作用进行进一步深入分析。