第一部分:胆固醇调节钠钾ATP酶α亚型特异性的研究　　实验目的：　　钠钾ATP酶α1在细胞内质膜胆固醇下降时出现表达下调，并激活Src蛋白激酶信号途径。本实验的目的旨在研究胆固醇下降时对钠钾 ATP酶α亚基不同亚型的表达和分布影响。　　实验方法：　　1.培养钠钾ATP酶α亚基不同亚型特异性表达细胞系，通过Western blot检测相应的钠钾ATP酶基础表达水平；　　2.通过总胆固醇测定试剂盒检测不同亚型特异性表达细胞中总胆固醇的含量；　　3.使用细胞内胆固醇转运抑制剂U18666A化合物处理不同亚型特异性表达细胞，通过Filipin染色技术检测游离胆固醇的分布；　　4.使用细胞内胆固醇转运抑制剂U18666A化合物处理不同亚型特异性表达细胞，通过Western blot检测细胞中相应钠钾ATP酶α的表达水平；　　5.经U18666A处理不同亚型特异性表达细胞后，通过免疫荧光技术检测细胞中相应钠钾ATP酶α的分布情况。　　6.经U18666A处理不同亚型特异性表达细胞后，使用生物素标记蛋白和Western blot技术检测细胞膜上相应钠钾ATP酶α的表达情况。　　7.经U18666A处理不同亚型特异性表达细胞，通过Western blot检测细胞中另一种跨膜蛋白Claudin-4的表达水平。　　实验结果：　　1.培养基因敲除钠钾 ATP酶的猪肾小管上皮细胞（PY-17细胞）、转染大鼠α1的AAC-19细胞、转染大鼠α2的LX-α2-4细胞及转染大鼠α3的LM-α3细胞，检测结果显示AAC-19细胞中钠钾ATP酶α1呈现高表达，且未检测到其他亚型表达， LX-α2-4细胞仅检测到α2表达，LM-α3细胞中仅α3表达；　　2.AAC-19、LX-α2-4及LM-α3不同亚型特异性表达细胞中，总胆固醇的含量无明显差别（P>0.05）；　　3.与AAC-19、LX-α2-4细胞基础状态相比较，LM-α3细胞中游离胆固醇在胞质内的分布较多，细胞膜上分布较少；　　4.使用U18666A化合物处理不同亚型特异性表达细胞，均导致游离胆固醇重新分布，质膜上胆固醇减少，胞质内胆固醇增加；　　5.使用U18666A化合物减少质膜胆固醇，可以下调钠钾ATP酶α1特异性表达细胞中的α1表达水平（P<0.01），且变化呈现时间及剂量依赖性；对α2及α3特异性表达细胞中相应α2及α3的表达无明显影响（P>0.05）；　　6.使用U18666A化合物减少质膜胆固醇，可以改变钠钾ATP酶α1特异性表达细胞中α1的分布，减少质膜上α1，增加胞质内α1（P<0.05）；但对α2特异性表达细胞中钠钾ATP酶的分布无明显影响（P>0.05）。　　7.使用U18666A化合物减少质膜胆固醇，可以减少钠钾ATP酶α1及α3特异性表达细胞中细胞膜上相应α1及α3的表达分布，增加内吞（P<0.01）；但不改变α2特异性表达细胞中α2在细胞膜上的表达（P>0.05）。　　8.经U18666A处理不同亚型特异性表达细胞，上调α1及α3特异性表达细胞中跨膜蛋白Claudin-4的表达水平（P<0.05），对α2细胞中Claudin-4的表达无影响（P>0.05）。　　实验结论：　　U18666A减少钠钾ATP酶α亚基不同亚型细胞内的质膜胆固醇，对α的表达及分布呈现亚型特异性调节作用，α1在功能复合物中作用独特。　　第二部分:Src与胆固醇调节钠钾ATP酶的机制研究　　实验目的：　　细胞内质膜胆固醇对钠钾ATP酶α1的调节被证实与Src蛋白激酶的激活密切相关。本实验旨在研究胆固醇在钠钾ATP酶α亚基与Src连接位点突变的细胞中，对α亚基不同亚型的调节作用，深入探讨钠钾ATP酶α与Src及胆固醇的相互作用，以及作用机制研究。　　实验方法：　　1.培养α1与Src连接区域CD3突变细胞A416P、A420P及A425P细胞，通过Western blot检测相应的钠钾ATP酶表达水平；　　2.三种A416P、A420P及A425P突变细胞经U18666A处理后，通过Western blot比较细胞中突变钠钾ATP酶α1的表达水平；　　3.培养α1与Src连接区域CD2突变细胞Y260A细胞，经U18666A处理后，通过Western blot比较细胞中突变α1的表达水平；　　4.培养AAC-19、LX-α2-4细胞和α2与Src连接区域突变系LY-a2细胞，通过Western blot检测比较细胞中钠钾ATP酶α及磷酸化Src、ERK1/2表达水平，免疫荧光技术检测比较α2分布情况；　　5.培养LY-a2突变细胞，加入U18666A处理后，通过Western blot比较细胞中突变α2的表达水平，通过免疫荧光技术检测细胞中α2的分布情况；　　6.培养LY-a2突变细胞，加入U18666A处理后，使用生物素标记蛋白和Western blot技术检测细胞膜上钠钾ATP酶α2的表达情况。　　实验结果：　　1.培养AAC-19细胞以及α1突变细胞系A416P、A420P与A425P细胞，Western blot结果显示A416P、A420P与A425P三种细胞中突变α1的表达水平一致，与AAC-19细胞中野生型大鼠α1的蛋白水平无明显差别；　　2.使用U18666A化合物减少质膜胆固醇24h及48h，均可下调A416P细胞中α1的表达水平（P<0.001）；减少质膜胆固醇48h可以减少 A420P细胞中α1水平（P<0.001），但24h无明显变化（P>0.05）；而减少质膜胆固醇不能改变 A425P细胞中α1的表达水平（P>0.05）；　　3.使用 U18666A化合物减少质膜胆固醇48h，可以减少α1与 Src连接突变细胞Y260A中突变α1蛋白的表达水平（P<0.05），但24h无明显变化（P>0.05）；　　4.α2突变系LY-a2细胞中α1蛋白表达水平极低，与LX-α2-4细胞相比较α2蛋白表达水平及分布一致（P>0.05），且 LY-a2细胞中 Src与 ERK基础激活水平均较AAC-19细胞高，较LX-α2-4低（P<0.05）；　　5.使用U18666A化合物减少质膜胆固醇48h，可以减少LY-a2细胞中突变α2蛋白表达水平（P<0.05），但24h无明显变化（P>0.05）；　　6.使用U18666A化合物减少质膜胆固醇48h，可以减少LY-a2细胞中质膜α2的分布，增加胞质内α2（P<0.01）。　　7.使用U18666A化合物减少质膜胆固醇24h，不改变LY-a2细胞中α2在细胞膜上的表达（P>0.05）；但48h后可以减少细胞膜上α2的分布，增加内吞（P<0.05）。　　实验结论：　　钠钾ATP酶α与Src之间的连接对胆固醇调节钠钾ATP酶α的表达及分布至关重要。　　第三部分:Caveolin-1与胆固醇调节钠钾ATP酶的机制研究　　实验目的：　　胞膜窖主要成分caveolin-1被证实对维持钠钾ATP酶α1功能和胆固醇的稳态密切相关。本实验旨在研究胆固醇在caveolin-1基因敲除细胞中对α1的调节作用，深入探讨钠钾ATP酶与Src、caveolin-1及胆固醇的相互作用及机制。　　实验方法：　　1.培养AAC-19细胞、PY-17细胞、LX-α2-4细胞、LY-a2细胞及LM-α3细胞，通过Western blot比较细胞中caveolin-1的基础表达水平；　　2.培养α1与Src连接区域突变细胞A416P、A420P及A425P细胞，通过Western blot检测caveolin-1的基础表达水平；　　3.培养AAC-19细胞、LX-α2-4细胞、LY-a2细胞及LM-α3细胞，通过蔗糖密度梯度离心法（fractionation）将相应的细胞分为11个部分，通过Western blot检测细胞中钠钾ATP酶、Src及caveolin-1于不同部分的表达分布情况；　　4.培养猪肾小管上皮 LLC-PK1细胞及基因敲除 caveolin-1的LLC-PK1细胞（C2-9细胞），通过Western blot比较细胞中caveolin-1的基础表达水平，加入U18666A处理后，通过Western blot比较C2-9细胞中相应钠钾ATP酶α1的表达水平；　　5.培养C2-9细胞，加入U18666A处理后，通过免疫荧光技术检测细胞中α1的分布情况。　　实验结果：　　1.与AAC-19细胞相比，LX-α2-4细胞和LM-α3细胞中caveolin-1基础表达水平明显降低（P<0.01），LY-a2细胞中caveolin-1与AAC-19中表达一致（P>0.05）；　　2.钠钾 ATP酶α1突变细胞 A416P与 A420P细胞中 caveolin-1蛋白表达水平与AAC-19细胞相比无明显差别，仅A425P细胞中caveolin-1比AAC-19细胞减少；　　3.AAC-19细胞、LX-α2-4细胞、LY-a2细胞及LM-α3细胞经梯度离心后，4/5低密度部分为caveolae富集的质膜部分，且caveolin-1在四种细胞中不同部分分布均一致（P>0.05）；与AAC-19细胞相比，LX-α2-4细胞中相应的钠钾ATP酶α及Src更多分布在较高密度的胞质部分（P<0.01），而非caveolae富集的4/5部分。LY-a2细胞相应α及Src的分布介于AAC-19与LX-α2-4细胞之间（P<0.05）；　　4.与LLC-PK1细胞相比，基因敲除C2-9细胞中无可检测到的caveolin-1蛋白表达；使用U18666A化合物减少质膜胆固醇24h，α1蛋白表达水平无明显变化（P>0.05），但更长时间处理48h，可以减少C2-9细胞中α1的表达（P<0.05）；　　5.使用U18666A化合物减少C2-9细胞中质膜胆固醇24h，对α1于细胞内的分布无明显影响（P>0.05）。　　实验结论：　　胆固醇调节钠钾ATP酶亦需要caveolin-1的表达。　　第四部分:钠钾ATP酶与胆固醇连接域对胆固醇调节钠钾ATP酶的机制研究　　实验目的：　　在大多数胆固醇结合蛋白中，“L/V-X(1-5)-Y-X(1-5)-R/K”被证实是胆固醇识别／结合氨基酸序列（CRAC）。本实验旨在研究钠钾ATP酶α1亚基中的胆固醇结合位点，及其在胆固醇调节钠钾酶表达和转运中的作用。　　实验方法：　　1.使用NCBI网站Blast软件进行氨基酸序列比对，找出钠钾ATP酶的胆固醇结合域；　　2.建立α1 CRAC突变细胞系（Y55S），比较α1突变细胞中钠钾ATP酶的表达；　　3.采用fractionation（细胞分级分离技术）检测比较AAC-19与Y55S突变细胞中钠钾ATP酶、caveolin-1及Src的分布表达；　　4.使用U18666A化合物处理Y55S细胞，通过filipin染色比较游离胆固醇于细胞内分布情况；；　　5.在Y55S突变细胞中，加入U18666A减少质膜胆固醇后，通过Western blot比较细胞中α1的表达。　　6.在Y55S突变细胞中，加入U18666A减少质膜胆固醇后，使用免疫荧光技术检测细胞中α1的分布；　　实验结果：　　1.人类钠钾ATP酶α1亚基N端中具备胆固醇识别／作用氨基酸序列(CRAC)，于不同物种中序列比较显示CRAC为保守序列。α2具备此保守序列，α3中无此序列。　　2.建立α1 CRAC突变细胞系（Y55S），使用特异性识别大鼠α1的多克隆抗体检测α1，结果显示Y55S中α1的表达量与AAC-19细胞相比，无明显差别（P>0.05）。　　3.经密度梯度离心后，与AAC-19细胞相比，Y55S细胞中钠钾ATP酶α1、caveolin-1及 Src更多分布于较高密度的胞质部分，较少集中在 caveolae富集的4/5部分（P<0.01）；　　4.使用U18666A化合物处理Y55S细胞24h，通过filipin染色可见质膜胆固醇分布减少，胞质内胆固醇分布增多；　　5.使用 U18666A化合物减少质膜胆固醇24，突变α1的蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）；　　6.使用 U18666A化合减少质膜胆固醇24h， Y55S细胞中α1的分布无明显变化（P>0.05）。　　实验结论：　　胆固醇通过钠钾ATP酶α的胆固醇连接区域调节α1表达与分布。