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随着人们生活水平的提高,畜禽养殖业发展迅速,但同时也产生了大量的畜禽粪便,带来了环境污染问题。畜禽粪便排放量的增加导致农田土壤消纳难度增大,粪便中残留的抗生素、病原菌及重金属等也转移到土壤中,增加了土壤污染风险,破坏了生态环境,制约了畜禽产业的可持续发展。堆肥发酵作为畜禽粪便重要的处置方式,发酵腐熟后产物可作为有机肥施用于农田土壤,提升土壤有机质水平和农产品的质量安全。然而,铜等重金属常作为饲料添加剂被广泛应用于畜禽养殖,在粪便中大量残留,给土壤等环境带来了风险,另外,畜禽粪便、堆肥发酵中的细菌长期处于高浓度重金属环境中,导致细菌对铜等重金属产生耐受性,这种耐受性可由染色体,以及可移动遗传元件（Mobile Genetic Elements,MGEs）如质粒等介导。芽孢杆菌（Bacillus spp.）常作为微生物态制剂广泛用于畜禽养殖,也作为腐熟剂添加应用于畜禽粪便堆肥发酵。研究发现粪污等环境中的芽孢杆菌对铜具有较高耐受能力,它们往往携带染色体介导的铜耐受基因（如copA、copB、copZ;cueR;ycnJ、ycnK等）以及质粒介导的pcoA、pcoB、pcoC等铜耐受基因,而质粒介导的耐受基因可在粪便、堆肥发酵及有机肥,甚至农产品中发生水平传播（Horizontal Transmission）,扩大宿主范围。重要的是,芽孢杆菌具有很强的抗逆性,可耐受高温,即使通过高温发酵仍可存活,进而携带铜耐受基因在环境中传播,给农业生产和公共卫生安全带来危害。鉴于此,本研究通过分离畜禽粪便中的芽孢杆菌,弄清畜禽粪便中芽孢杆菌对铜耐受情况;筛选较高铜耐受能力但未携带质粒介导耐受基因的耐受菌株,用于畜禽粪便堆肥发酵,研究菌株添加后堆肥发酵效果。主要研究及发现如下:（1）畜禽粪便中芽孢杆菌分离鉴定通过收集规模化畜禽养殖企业的畜禽粪便,分离出芽孢杆菌属23种芽孢杆菌共235株。分离出枯草芽孢杆菌（B.subtilis）77株,占总数的32.77%;蜡样芽孢杆菌（B.cereus）31株,占比13.19%;贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）28株,占比11.91%。从畜禽粪便源看,牛粪源分离出122株,占总比例的51.91%,分离数量排前三的依次是枯草芽孢杆菌（B.subtilis）31株、蜡样芽胞杆菌（B.cereus）26株、贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）17株,分别占牛粪分离的25.41%、21.31%、13.93%;猪粪源分离出64株,占比27.23%,分离数量排前三的依次是枯草芽孢杆菌（B.subtilis）25株、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）6株、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）5株,分别占猪粪分离的39.06%、9.38%、7.81%;鸡粪源分离出49株,占比20.85%,分离数量排前三的依次是枯草芽孢杆菌（B.subtilis）21株、贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）8株、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）3株,分别占鸡粪分离的42.86%、16.33%、6.12%。（2）芽孢杆菌对铜耐受表型和基因型的研究分离出的235株芽孢杆菌中,大部分对铜MIC集中在200～400 mg/L范围内,占总数的77.87%（n=183株）,铜耐受能力较高的菌株能够达到500 mg/L至600 mg/L,占总数的16.17%（n=38株）。MIC为0 mg/L、100mg/L时,贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）占比最高,分别为62.5%（n=5株）、50.00%（n=3株）;MIC 200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L时,枯草芽孢杆菌（B.subtilis）均占比最高,依次为27.06%（n=23株）、23.81%（n=5株）、42.86%（n=33株）、39.39%（n=13株）;MIC600 mg/L时,解淀粉芽孢杆（B.amyloliquefaciens）占比最高,为40.00%（n=2株）。MIC为0 mg/L时8株芽孢杆菌全部来自于牛粪源;5株MIC达到600 mg/L的菌株全部来自于猪粪源。通过PCR技术检测了pcoA、pcoC、pcoD、pcoR、copA、copB六种铜耐受基因,结果发现pcoC检出率最高（n=71株,P=30.21%）,检出率最低的为pcoR（n=15株,P=6.38%）。由6种检测到的基因形成了42种携带组合情况,pco系统铜耐受基因组合情况共计39种,仅携带cop系统铜耐受基因的组合情况仅3种,分别为copA（P=22.98%）、copB（P=15.32%）、copA-copB（P=5.96%）。牛粪源和猪粪源中检测出铜耐受基因分布比例最高的是pcoC,分布百分比分别为P=42.35%（n=36）、P=24.18%（n=22）,鸡粪源中检测出铜耐受基因分布比例最高的是pcoD,P=38.98%（n=23）。（3）铜耐受高温芽孢杆菌全基因组特征分析筛选出不含pco系统铜耐受基因的高温菌株进行全基因组测序。结果发现,5株枯草芽孢杆菌中均携带copA,Y3仅携带cueR、copA,69-1携带csoR、copA、copZ,49-9、50-5、52-8这3株均携带cueR、ycnJ、ycnK、csoR、copA、copZ铜耐受基因。进一步分析基因上下游环境和基因特征,发现49-9、50-5、52-8菌株中各自携带ycnJ、ycnK基因;5株菌中分别都存在copA基因,在49-9、50-5、52-8、69-1四株菌中均存在copZ、csoR基因。根据各个基因的具体功能初步解析了枯草芽孢杆菌对铜的耐受机制。从5株来源不同的枯草芽孢杆菌中筛选出耐受基因携带最少、耐受温度最高,在65℃下仍能生长的菌株Y3作为堆肥发酵应用菌株。（4）枯草芽孢杆菌Y3菌株在堆肥发酵中的应用分析堆肥发酵产物的各项指标,包括pH、腐熟度、有机质、全氮等,对堆肥样品进行了16S rRNA高通量测序分析,研究其菌群变化情况。结果显示,CK组pH波动范围在7.20～7.70之间,Y3组pH值波动范围在7.40～7.80之间,均略高于CK组;堆肥发酵末期时Y3实验组的有机质质量分数（以烘干基计）为62.12%,总养分（N+P2O5+K2O）质量分数（以烘干基计）为4.41%,种子发芽指数（GI）为123.31%,均优于CK组对应的有机质质量分数（以烘干基计）54.09%、总养分（N+P2O5+K2O）质量分数（以烘干基计）4.14%、种子发芽指数（GI）101.17%,说明添加Y3作为外源微生物菌剂可促进堆肥发酵,优化堆肥发酵产品。堆肥样品16SrRNA高通量测序结果发现,Y3组和CK组菌群变化也较大。堆肥末期,厚壁菌门（Firmicutes）成为两组中丰度最大的菌门。属水平上,CK组中前期假单胞菌属（Pseudomonas）菌群丰度优势显著,在堆肥末期发挥主要作用的是Limnochordaceae中的Limnochorda。Y3组潜在病原菌属假单胞菌属（Pseudomonas）、弓形菌属（Arcobacter）、不动杆菌属（Acinetobacter）等菌群丰度均有下降,而Limnochordaceae、芽孢杆菌属（Bacillus）、莫氏杆菌（Moheibacter）、氢孢菌（Hydrogenispora）等菌群丰度均上升,Limnochordaceae菌群丰度优势最显著（p＜0.05）。研究筛选出的枯草芽孢杆菌（B.subtilis）Y3不携带质粒介导的铜耐受基因,具备一定铜耐受能力（MIC 400mg/L）,能耐受65℃高温,促进堆肥发酵腐熟,影响堆体菌群结构,降低堆体中潜在病原菌相对丰度,使堆肥产物能达到有机肥标准,具有实际应用价值。本研究对于控制耐受基因在环境中的传播,对养殖业健康发展、土壤环境安全具有重要意义,可为芽孢杆菌在畜禽粪便资源化中安全应用提供支撑。