研究目的　　 近年来Toll样受体家族(Toll-like Receptor，TLRs)在机体免疫应答中的作用受到高度关注。TLRs家族成员作为一种模式识别受体(patternrecognition receptor，PRR)可特异性识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，不仅在激活天然免疫中发挥重要作用，而且还在诱导和调节获得性免疫中具有重要意义，是连接天然免疫和获得性免疫的重要桥梁。TLRs信号可以在自身抗原，同种抗原和异种抗原的刺激下激活。近来发现TLRs显著影响血管内皮细胞的活性与功能。其中TLR4可与脂多糖（Lipid Polysaccharide，LPS）特异性结合，上调血管内皮细胞TLR4的表达，介导机体的炎症和免疫应答，参与多种病理过程的发生发展，包括动脉粥样硬化等。　　 巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一种有多种免疫细胞分泌的多能细胞因子，在急慢性炎症疾病、动脉粥样硬化、应激反应、移植排斥和肿瘤发生发展中具有重要意义。近来研究表明MIF可以明显影响小鼠树突状细胞的TLR4表达，其特异阻断剂ISO-1可以明显抑制单核细胞表面TLR4诱导的前炎性因子的分泌。但是巨噬细胞移动抑制因子对血管内皮细胞的TLR4的表达及TLR4介导的生物学活性是否有影响目前尚未见报道。　　 本研究采用单克隆抗体(mAb)分别阻断血管内皮细胞的TLR4和MIF，研究其对血管内皮细胞TLR4表达、细胞增殖、黏附活性和相关细胞因子分泌的影响，旨在进一步探讨TLR4与MIF对血管内皮细胞活性的影响，从而为探讨TLR4与MIF的相互作用及意义提供实验依据。　　 实验方法　　 1.实验分组：　　 ECV304细胞传代培养后，分为对照组、LPS组(LPS1、5、10mg/L)、TLR4阻断组（抗TLR4 mAb，1μg/ml）和MIF阻断组(抗MIF mAb，10、50、100mg/L)。　　 2.采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对各组细胞的TLR4 mRNA的表达进行测定。　　 3.利用抗TLR4单克隆抗体免疫荧光染色观察不同处理组ECV304细胞表面TLR4蛋白表达状况。　　 4.通过3H-TdR掺入实验研究各组细胞增殖状况。　　 5.通过黏附实验分析研究外周血淋巴细胞对血管内皮细胞的黏附能力。　　 6.通过放射免疫分析研究不同处理组ECV304细胞TNFα和IL-8分泌水平。　　 实验结果　　 1.ECV304细胞明显表达TLR4 mRNA，LPS(10gg/L)处理48h，可以明显促进ECV304细胞TLR4 mRNA的表达，而小剂量LPS(1mg/L)对ECV304细胞TLR4 mRNA表达无显著作用；抗MIF抗体(10、50mg/L)均显著抑制ECV304细胞TLR4 mRNA的表达(p<0.O5)。　　 2.免疫荧光染色结果表明，正常条件下，ECV304细胞表达TLR4，但是强度较弱，LPS处理明显增强了ECV304细胞TLR4的表达，荧光染色阳性细胞增多，且强度增强；而抗MIF处理组，TLR4的表达受到明显抑制，荧光强度明显下降，与未处理组物显著差异。　　 3.LPS(10mg/L)处理48h可以明显促进ECV304细胞的增殖，而抗MIF（50mg/L）和抗TLR4(1mg/L)处理48h可以明显抑制ECV304细胞的增殖，尤以后者作用更加明显，与对照组相比有显著差异(P<0.05)。　　 4.在培养的ECV304细胞中加入抗MIF mAb(50mg/L)处理48h后，可以明显抑制人外周血淋巴细胞黏附ECV304细胞(P<0.05)，而LPS(1mg/L)和抗TLR4单抗(lmg/L)的处理对淋巴细胞与ECV304的黏附无明显影响。　　 5.与对照组相比，LPS(1mg/L)处理ECV304细胞48h，可以明显促进ECV304细胞TNFα的分泌，(P<0.05)，且随着LPS浓度的提高(1、5、10mg/L)，血管内皮细胞分泌TNFα的水平明显升高，呈显著的剂量依赖性；而抗MIF(50mg/L)和抗TLR4 mAb(1mg/L)阻断48h可以明显抑制TNFα分泌，统计学处理有显著差异(P<0.05)，且随着抗MIF抗体浓度的升高(10、50、100mg/L)，血管内皮细胞分泌TNFα的水平明显下降，也呈明显的剂量依赖性(P<0.05)。LPS(10mg/L)处理ECV304细胞12、24、48h均可明显促进TNFα分泌；抗MIF mAb(50mg/L)处理24h和48h，可以导致血管内皮细胞TNFα分泌明显下降(P<0.05)。　　 6.与对照组相比，LPS(lmg/L)处理ECV304细胞48h，可以明显促进ECV304细胞IL-8的分泌，而抗MIF mAb的阻断(50mg/L，48h)可以明显抑制IL-8的分泌(P<0.05)。但是抗TLR4 mAb(1mg/L)处理48 h对ECV304细胞IL-8的分泌无显著影响，统计学处理无显著差异。　　 结论　　 TLR4的特异激活剂LPS(10mg/L)明显促进了ECV304细胞TLR4的基因和蛋白表达；促进ECV304细胞增殖与黏附，促进ECV304细胞TNFα和IL-8的分泌；而抗TLR4抗体处理明显抑制了ECV304细胞增殖，抑制细胞的TNFα分泌，但是对细胞黏附和IL-8的分泌无显著影响；抗MIF单抗处理显著抑制了TLR4的基因和蛋白表达，抑制了细胞增殖和黏附，显著抑制TNFα和IL-8的分泌。结果提示MIF的作用与LPS类似，其对血管内皮细胞活性的影响主要尾通过TLR4途径实现的，IL-8的分泌及细胞黏附活性可能还存在TLR4以外的途径。