据世界卫生组织估计,全球有490万人患有双侧角膜盲,单侧角膜盲的患病人数约为2300万人。对于严重的角膜损伤,进行角膜移植是目前最有效的治疗手段。但全世界捐赠角膜数量有限,解决这种短缺的方法之一便是使用组织工程化全部或部分厚度的角膜移植物。组织工程种子细胞来源多为干细胞,其中骨髓间充质干细胞(Bone marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)来源广泛,使用方便,且免疫原性低,为种子细胞的首选。现阶段在角膜损伤的治疗中多使用生物相容性好的羊膜作为支架材料来负载干细胞。目前研究中已发现通过体外间接接触共培养的方式BMSCs可以向角膜上皮细胞分化,但在使用BMSCs治疗角膜损伤时,受到早期损伤部位微环境的影响,BMSCs在损伤部位很难存活;使用羊膜作为支架材料面临材料来源有限,成本较高的问题。为解决以上问题,本课题进行了以血浆纤维蛋白膜为支架负载BMSCs与角膜上皮细胞,作为组织工程角膜植片,对角膜损伤修复的实验研究。研究工作主要包括以下内容:1大鼠BMSCs及角膜上皮细胞的分离培养与鉴定采用全骨髓贴壁法提取大鼠BMSCs,体外培养贴壁生长,呈梭形,排列呈旋涡状,具有方向性;流式细胞术检测发现,所提取的大鼠BMSCs表面抗原CD90呈阳性,CD34呈阴性,与文献报道一致。采用酶消化法对大鼠角膜上皮细胞进行分离提取,细胞贴壁生长,呈多角形,免疫荧光结果显示所提取的细胞表达角膜上皮细胞的特异性蛋白CK12。2角膜上皮细胞对接触共培养BMSCs的诱导分化使用CFSE对BMSCs进行标记,然后将BMSCs与角膜上皮细胞按照1:3、1:1、3:1的比例进行7天接触共培养。然后,流式细胞术分选出BMSCs后,采用qRT-PCR检测BMSCs中角膜上皮细胞相关基因p63、CK12的mRNA水平。结果显示,原本不表达p63、CK12基因的BMSCs在与角膜上皮细胞进行接触共培养后表达这两种角膜上皮细胞相关基因,且随着共培养体系中角膜上皮细胞比例的升高,BMSCs中这两种角膜上皮细胞相关基因的表达量均上升。这一结果表明受直接接触共培养的角膜上皮细胞诱导BMSCs呈现向角膜上皮细胞分化的改变,且共培养体系中角膜上皮细胞的比例影响BMSCs的分化程度。3血浆纤维蛋白膜的制备与性能检测3.1制备通过颈静脉窦取血获得大鼠全血,离心后取上层血浆,加入Ca2+促凝后获得血浆凝胶,压缩除去凝胶内多余液体后冻干,获得血浆纤维蛋白膜。3.2扫描电镜观察膜片结构扫描电镜检测发现,血浆纤维蛋白膜片表面微孔分布较为均匀,孔径大小多分布在25～30μm,多孔结构有利于细胞附着与及营养物质的运输。3.3流变仪检测所制膜片粘弹性对冻干复水的膜片与新鲜膜片分别进行流变学检测,结果显示二者的弹性模量G’均大于粘性模量G",且冻干复水膜片的G’与G"均大于新鲜膜片。这一结果表明冻干后复水的血浆纤维蛋白膜相较新鲜膜片有着更好的粘弹性,不易发生形变,即刚度更高,负载细胞后将其用于移植治疗时操作更便利。3.4扫描电镜观察血浆纤维蛋白膜上细胞负载情况将分离培养的BMSCs和角膜上皮细胞接种于冻干复水的血浆纤维蛋白膜上,培养24h后,采用超临界干燥技术获得负载细胞的干燥膜片。对其进行扫描电镜观察,发现两种细胞均存在于膜片表面,表明所制备的血浆纤维蛋白膜片可以用做负载细胞的支架。4血浆纤维蛋白膜片负载BMSCs及角膜上皮细胞对大鼠角膜碱烧伤的治疗4.1对大鼠碱烧伤后角膜损伤愈合情况的影响利用荧光素钠染色法检测了在角膜碱烧伤3、7天时大鼠角膜上皮损伤的愈合情况。结果发现,随着损伤后天数的增加,损伤组、空白膜片组与负载细胞膜片组的大鼠角膜上皮缺损率均有不同程度的减少;在3天和7天,角膜上皮细胞的缺损率均为损伤组>空白膜片治疗组>负载细胞的膜片治疗组,且各组之间的上皮缺损率均有显著性差异(p<0.0001)。在角膜碱烧伤后第7、14天对角膜损伤部位进行了 HE染色观察,结果发现随着天数的增加,三组大鼠角膜损伤部位的上皮及基质结构都有着不同程度的恢复,其中空白膜片组与负载细胞膜片组角膜损伤部位结构恢复更好,后者角膜损伤部位结构恢复最好,在第14天时已接近正常角膜结构。这一结果表明,使用自制负载细胞膜片可以有效促进角膜损伤的愈合。4.2对大鼠碱烧伤后炎症反应的影响采用免疫荧光染色方法检测了大鼠角膜碱烧伤后7天、14天角膜组织中基质金属蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9),金属蛋白酶组织抑制剂-1(Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-1,TIMP-1),白介素-6((Interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)的表达。结果发现,第7天和第14天负载细胞的膜片治疗组与空白膜片治疗组角膜中,这四种炎症相关因子的表达相较于损伤组都有着不同程度的减少,负载细胞的膜片治疗组角膜中这些炎症相关因子的表达最少。这说明纤维蛋白膜片可以减轻大鼠角膜碱烧伤后炎症反应,在膜片负载细胞后对炎症的抑制效果更好。4.3对大鼠碱烧伤后角膜纤维化的影响采用免疫荧光染色方法检测了大鼠角膜碱烧伤后第7天、第14天角膜组织中平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的表达。结果表明,第7天和第14天负载细胞的膜片治疗组与空白膜片治疗组角膜中α-SMA的表达相较于损伤组都有着明显的减少,负载细胞的膜片治疗组角膜中α-SMA的表达最少。这说明纤维蛋白膜片可以抑制大鼠角膜碱烧伤后的角膜纤维化,在膜片负载细胞后抑制角膜纤维化的作用更强。4.4负载BMSCs及角膜上皮细胞的血浆纤维蛋白膜片中BMSCs在大鼠角膜碱烧伤部位的分化与植入利用 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-1-(2-deoxy-β-D-ribofuranosyl)uracil5-Bromouracil deoxyriboside,5-BrdU)标记对 BMSCs 进行示踪以检测 BMSCs 在损伤角膜组织的植入情况。结果显示,在第7天没有在角膜损伤部位检测到BMSCs,但在第14天时在角膜损伤部位检测到有少量BMSCs,且免疫荧光染色后发现BMSCs表达CK12。这表明以血浆纤维蛋白膜支架以及负载的角膜上皮细胞组成的微环境下,BMSCs在早期修复阶段(7～21天)可以植入到损伤部位,并能够向角膜上皮细胞分化。总之,本课题将BMSCs与角膜上皮细胞装载于自制的血浆纤维蛋白膜支架上制备了组织观察细胞膜片,移植用于大鼠角膜碱烧伤时,显示出有效减轻角膜损伤部位炎症反应,抑制角膜损伤部位的纤维化程度,加快角膜伤口愈合的作用,还发现部分BMSCs成功植入大鼠角膜损伤部位并向角膜上皮细胞分化。这些结果提示,该组织工程细胞膜片值得进一步研究,或有望为角膜损伤提供新的治疗方案,为构建组织工程角膜提供新的组合方式。