家蚕(Bombyx mori)是完全变态的鳞翅目昆虫,一生经历卵、幼虫、蛹和蛾四个在形态结构和机能上完全不同的发育阶段。其中, 幼虫期是家蚕摄取食物进行生长的阶段,所汲取的营养物质除了完成个体的生长外,还在幼虫末期用来合成丝蛋白以形成蚕茧,同时为蛹体的构建储备营养物质；家蚕幼虫生民到合适的大小,遂开始吐丝结茧,并在茧层内完成幼虫向蛹的转变。蛹期是幼虫过渡到成虫的变态阶段,为生殖系统的发育和成虫器官的形成提供关键支持。毫无疑问,蚕蛹对于家蚕的繁衍至关重要,而茧层则主要保护蚕蛹免遭自然环境危害、微生物感染和天敌猎食,同时可以用来生产具有重要经济价值的蚕丝。一个蚕茧的茧层和蚕蛹的重量通常是平衡的,如果茧层太少,不利于蚕蛹保护；而蚕蛹太小,又不利于生殖。正因为如此精妙的进化,家蚕在地球上才能生存至今。茧层和蚕蛹的平衡关系通常用茧层率来反映,该指标是指茧层重占茧重的百分比。目前,生产上使用的家蚕,其茧层率分布范围大概在10%到30%之间。尽管杂交选育可以使该性状得到一定程度的优化,但是很难突破30%。究其原因有以下几个方面：茧层率性状受到遗传调控,其遗传稳定性受环境影响较小,而受品种的影响相对较大；茧层重与蛹体重之问具有高度正相关性,相关系数为0.85；家蚕吸收的干物质用于形成茧层和构建蛹体的比例约为1：1。这些证据表明,家蚕在长期进化过程中形成一种精密的调控机制,以确保家蚕用于合成茧层和构建蛹体的营养物质处于动态平衡状态。家蚕丝-蛹营养平衡是其为了生存的生物学行为,是其长期进化过程中有趣的生物学现象,对其调控机制的研究可为生产上人为操控家蚕分配更多的营养物质形成蚕丝提供切入点。鉴于此,本研究选择了三组家蚕丝-蛹营养失衡的生物材料,即突变体裸蛹、摘除丝腺和敲除丝蛋白基因的家蚕,结合代谢组学和蛋白质组学技术,系统比较分析所选材料的代谢物差异以及代谢通路中关键酶的变化,筛选影响丝-蛹营养平衡的代谢通路和关键调控基因,进-步开展生物学功能验证。获得的主要研究结果如下：1.家蚕丝-蛹营养物质失衡自然突变体血淋巴的代谢组学我们首先调查了7个家蚕品种的茧层率,它们之间的茧重相差较大,除裸蛹外,其余品种的茧层率均在10%到30%之间。而裸蛹因其后部丝腺严重退化,导致其合成的丝蛋白量显著降低。因此,本研究选择裸蛹(Nd)作为反证材料,同时选择Dazao和21-872作为对照(为了描述方便将它们命为Nd组),探究家蚕丝-蛹营养平衡的调控机制。首先测定Nd组生化指标,结果显示五龄第3天,Nd血淋巴中海藻糖含量较高,脂肪体中糖原和ATP含量较高,三酰甘油含量较低。本研究建立了一套家蚕血淋巴的“全组分”非靶向代谢组学分析方法。运用该方法对Nd组血淋巴进行检测,最终获得100个结构被鉴定的化合物,并对其中的82个化合物进行了标准品验证。对五龄第3天到第6天Nd组血淋巴代谢特征的主成分分析发现,Nd与Dazao或21-872具有明显的分离趋势,两个对照之间没有分离趋势。这一结果说明,Nd血淋巴中有与对照存在差异的代谢物。将五龄第6天的Nd与Dazao进行比较,获得46个化合物结构被鉴定的差异代谢物。其中有15个代谢物在Nd血淋巴中含量高于Dazao,主要包括尿酸、甘氨酸、氨基丙二酸、丝氨酸、脯氨酸、羊毛硫氨酸、乙醇酸和谷氨酸等,特别是尿酸和甘氨酸在Nd中的富集尤为明显。Nd血淋巴中含量低于Dazao的代谢物有31个,主要包括糖类(肌醇、来苏糖、2-酮基-葡糖酸)、三羧酸TCA循环(柠檬酸、苹果酸、延胡索酸,)的中间代谢物、脂类及脂代谢途径(甘油酸、胆固醇、十八酸、甘油、亚麻酸)和氨基酸等(甲硫氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、羟脯氨酸)。2.人为阻碍丝蛋白合成导致家蚕丝-蛹营养失衡的代谢组学研究敲除家蚕丝素重链基因Bmfib-H (Bmfib-H gene knock-out, FGKO)、摘除家蚕丝腺(Silk glands extirpation, SGE)都能够阻碍丝蛋白的合成,导致丝产量急剧降低、蛹体重显著增加。为了描述方便将Bmfib-H基因敲除品系和其对照统称为FGKO组,摘除丝腺、假手术和正常统称为SGE组。首先进行了生物学统计,结果表明FGKO的蛹重增加了19.08%,茧层率降低了67.2%。SGE的蛹重增加了32.49%。之后的PLS-DA分析表明,FGKO组或SGE组血淋巴代谢特征发现处理组与其对照的分离趋势都非常明显,这说明敲除Bmfib-H基因或摘除丝腺后血淋巴的代谢特征发生了显著变化。在此基础上,开展了差异代谢物的筛选,结果发现FGKO组中有60个结构被鉴定的差异代谢物,其中仅有5个代谢物在敲除Bmfib-H基因后含量升高。SGE组摘除丝腺和假手术之间存在66个结构被鉴定的差异代谢物,其中只有9个差异物代谢物在摘除丝腺后含量升高。FGKO组和SGE组的大多数差异代谢物与Nd组的差异代谢物变化趋势类似,即甘氨酸、氨基丙二酸、丝氨酸、尿酸和脯氨酸等含量增加,鸟氨酸、提供能量的物质(自由脂肪酸、糖类物质、TCA循环中间代谢物)含量降低。进一步综合分析表明,同时在三组生物材料中都能检测到的差异代谢物有16个,至少能在其中两组中检测到的差异代谢物有51个。对这些共同鉴定到的差异代谢物进行代谢通路富集分析,结果显示较多差异代谢物集中在甘氮酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径,氮代谢途径和氨酰-tRNA生物合成途径等。FGKO组差异代谢物相关性分析显示差异代谢物聚类为两个簇,并以甘氨酸、氨基丙二二酸作为桥梁连接它们,且甘氨酸与茧层率的相关系数绝对值高达0.892。以上结果说明甘氨酸在家蚕丝-蛹营养平衡中扮演重要角色。3.家蚕FGKO组脂肪体的蛋白质组学研究分别在Dazao和Bmfib-H基因敲除后脂肪体中鉴定到1767和1705个蛋白质。应用BLAST2GO程序对蛋白质功能进行注释,并根据功能注释将其分为20类,主要包括酶类、30K蛋白、转录与翻译相关蛋白、热激蛋白、SP蛋白、能量相关蛋白、转移酶、细胞骨架、蛋白酶及蛋白酶抑制剂等。酶类在脂肪体中的丰度最高,Bmfib-H基因敲除后酶类丰度有所下降。转录和翻译类蛋白在脂肪体中的丰度也较高, Bmfib-H基因敲除后转录翻译类蛋白质的丰度显著增加。推测敲除Bmfib-H基因后脂肪体将合成更多的蛋白质,然后储存于蛹体或者为蛹期蛋白质的合成提供物质基础。另外,能量相关蛋白、免疫相关蛋白的丰度在Bmfib-H基因敲除后明显提高,性别特异贮藏蛋白(SP protein)、转移蛋白酶和蛋白酶抑制剂在敲除Bmfib-H基因后的丰度显著降低。利用非标定量LFQ方法筛选获得662个差异蛋白质。酶类有155个,其中含量降低的酶有113个。转录翻译相关蛋白有86个,其中75个蛋白质含量升高,这说明敲除Bmfib-H基因后,脂肪体中蛋白质的合成更加旺盛。对差异蛋白质参与的代谢途径分析结果显示,参与糖酵解、磷酸戊糖途径和甘氨酸-丝氨酸合成途径中的大多数酶的含量都有所降低；参与氧化磷酸化途径中大多数酶的含量都有所增加。FGKO组脂肪体的蛋白质组学研究结果表明脂肪体中糖代谢减弱；甘氨酸、丝氨酸的合成降低；蛋白质的合成增加。基于上述结果,我们测定了脂肪体中糖原和蛋白质的含量,结果显示糖原和蛋白质的含量都显著增加。这说明FGKO阻碍丝蛋白的合成,这使更多的营养物质以糖原和蛋白质的形式存储于脂肪体中。4.家蚕甘氨酸转运蛋白基因BmGT1的功能研究代谢组学研究结果发现丝-蛹营养失衡后,血淋巴中甘氨酸含量显著增加。为了进一步探究甘氨酸在丝-蛹营养平衡中所发挥的作用,我们通过体外注射方式向蚕体血淋巴中添加额外的甘氨酸或调控甘氨酸的ACPC。检测能够反映丝-蛹关系的茧层率,结果显示注射甘氨酸或ACPC后分别增加了3.54%和3.89%。进一步的蛋白质组学分析显示,脂肪体中甘氨酸-丝氨酸合成途径中的关键酶含量有所降低。在此基础上,我们利用qPCR技术检测这些酶在丝-蛹营养失衡后的中肠、脂肪体和丝腺中的表达变化情况,结果发现丝氨酸合成途径中的基因BmPSGDH、 BmPSAT, BmPSPH在敲除Bmfib-H基因后中肠中表达量显著降低；相反,甘氨酸合成途径相关基因BmSHMT、BmAGXT、BmGMT、BmOAT在中肠中表达量升高。同时,家蚕甘氨酸转运蛋白基因BmGT1在FGKO和SGE的中肠中表达量显著降低。BmGT1基因是家蚕受人工选择的候选基因之一,与人类生长疾病相关基因同源。该基因编码的蛋白质与多巴转运载体三维结构高度同源,并且该基因在中肠中特异表达。因此,我们对该基因开展了生物学功能的验证。首先在细胞水平上添加甘氨酸或ACPC,结果使BmGT1基因的表达量显著降低。与此同时,细胞水平干涉或过量表达该基因,结果影响了甘氨酸-丝氨酸合成途径中关键酶的表达量。个体水平上注射该基因的抑制剂后,家蚕的茧层率显著提高,增加了5.986%。综上所述,BmGT1基因与家蚕丝-蛹营养平衡调控密切相关。本研究结合了代谢组学和蛋白质组学技术,选取三组生物材料进行研究,这三种材料在不同程度上阻碍了丝的合成,导致家蚕丝-蛹营养失衡。研究结果显示,甘氨酸和甘氨酸合成途径中的关键酶在代谢物水平、蛋白质水平和核酸水平上都发生了显著变化,并通过代谢物注射的方法,证明了甘氨酸在家蚕丝-蛹营养平衡中发挥着重要的作用。最后,应用分子生物学研究策略,验证了甘氨酸转运蛋白基因BmGT1通过调节甘氨酸-丝氨酸合成途径,进而控制甘氨酸含量,从而维持家蚕丝-蛹营养平衡。