论文部分内容阅读
抗生素耐药性（AMR）是当前全球性的公共卫生问题,影响着人类、动物的健康和环境卫生。AMR的出现和传播使得抗生素在治疗和预防感染方面的有效性受到了挑战,也加剧了疾病治疗的难度和成本。金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）,为革兰氏阳性菌,是人畜共患病致病菌,其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种多重耐药病原菌,耐药性非常严重,传播率和死亡率极高,引发了许多感染性疾病,包括皮肤及软组织感染到严重的心内膜炎、菌血症、肺炎、败血症、骨髓炎甚至导致机体死亡,也是畜牧业奶牛和羊乳房炎等的主要病原菌,造成极大的经济损失,对临床实践构成了重大威胁。由于新型抗菌药物的严重稀缺,当务之急是寻找新的方法来对抗日益强大和不断进化的多重耐药病原菌。基于毒力因子在细菌的黏附、定植、侵袭、扩散及免疫逃避等方面发挥着关键作用,使得抗毒力治疗成为当前的研究热点,相关的抗菌策略正在被开发。相对于直接杀死或限制细菌生长的传统抗生素,抗毒力治疗旨在解除或降低病原体的毒力,减弱细菌的致病性。此外,抗毒力治疗不给予细菌生存压力,一定程度上能避免耐药性的产生。因此,抗毒力治疗成为对抗多重耐药病原菌的新型策略。α-溶血素（Hla）也称为α-毒素（AT）,是一种几乎所有毒力强大的细菌菌株均能产生的孔状外毒素。Hla在细胞膜表面自组装形成七聚体,引起细胞内容物的渗漏,进而导致细胞的死亡。由于Hla在金葡菌感染的发病机制中的关键作用,它已成为对抗MRSA的主要候选目标。在新药研发和临床用药中天然产物及其衍生物占有很大比重,有相当数量含有天然产物的分子片段（60%以上）,甚至直接来源于天然产物。为此,本研究从天然小分子库中筛选抑制金葡菌溶血作用的天然小分子化合物——五味子酮,揭示其作用机制,并在体内评估其对MRSA感染小鼠肺炎模型的治疗作用,为对抗MRSA提供新的候选物。研究结果如下:（1）溶血实验表明32μg/m L的五味子酮能有效地抑制包括MRSA、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）和临床分离菌株的溶血活性,溶血抑制率分别为83.06±0.19%,68.27±0.68%和92.17±0.27%。（2）Hla七聚体的形成与Hla介导的细胞侵袭紧密相关,寡聚实验证实五味子酮不影响脱氧胆酸诱导的Hla低聚体。中和试验和细胞内热稳定迁移（CETSA）等试验表明五味子酮与Hla之间并无直接相互作用,这就表明五味子酮是Hla的间接抑制剂且不影响七聚体的合成。（3）Hla的表达受到由多个调控子组成的调控网络的控制,其中辅助基因调控（Auxiliary gene regulation,Agr）系统处于核心的地位。RT-qPCR和western blot结果表明,五味子酮以剂量依赖的方式抑制了Hla的转录和蛋白质水平,在使用五味子酮的浓度为32μg/m L时,m RNA和蛋白水平分别下降约10倍和4倍。此外,五味子酮还抑制了Agr系统相关基因RNAIII,agrA的转录水平变化,32μg/m L时,m RNA水平分别下降6倍和5倍。这一结果表明五味子酮可能通过干扰Agr群体感应系统来调节Hla的表达,从而影响其溶血活性,但不排除其它调控因子也可干预五味子酮进而影响溶血活性。（4）通过构建pET28a-agrA原核表达载体,经IPTG诱导表达获得agrA蛋白。随后热稳定迁移（TSA）、荧光淬灭、凝胶迁移实验（EMSA）、分子对接和动力学模拟等实验证实五味子酮与agrA之间存在直接相互作用。TSA实验结果表明五味子酮与agrA结合使ΔTm值为3℃,表明两者存在直接相互作用。荧光淬灭显示五味子酮与agrA的结合常数KA为8.2×10~4 L/mol,表明五味子酮与agrAc之间存在强烈的相互作用。此外,分子模拟结果显示总结合自由能为-42.588 k J/mol,其中ASP157,LYS167,ASP176,ASN177是五味子酮与agrA结合的关键氨基酸位点。（5）确保药物的安全性是其进一步开发的基础,细胞毒性实验显示在五味子酮（64μg/m L）高于抑制溶血浓度下,对来源于人的肺、肝和肾的A549,HEK293T及HepG细胞无明显的细胞毒性。此外,小鼠急性毒性进一步证实皮下一次性注射600 mg/kg的五味子酮对小鼠的生存情况没有影响。30天喂养实验也证实了五味子酮具有一定的安全性。（6）金葡菌引发肺炎感染,首先需要突破肺上皮细胞的屏障。当五味子酮被添加到肺上皮细胞A549和金葡菌的共培养系统中时,它明显减少了A549细胞损伤和LDH的释放水平,对肺上皮细胞表现出较好的保护作用,这意味着五味子酮可能对金葡菌引起的感染具有保护作用。（7）在MRSA诱导的小鼠肺炎感染模型中,五味子酮处理组显著提高致死剂量金葡菌感染小鼠的存活率,肺部组织中的定植菌落数量及肺部的损伤程度也明显降低,炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量也有显著的变化,这可能是通过调控群体感应系统来减弱金葡菌的毒力实现的。（8）抗毒素和传统抗生素的联合使用具有显著优势。一方面,减少抗生素使用量可降低病原菌耐药风险。另一方面,抗毒素削弱细菌致病性,有利于宿主免疫系统清除细菌。本研究通过棋盘法和时间杀菌曲线发现并确证五味子酮与头孢噻呋具有协同对抗MRSA的作用（FIC指数为0.125）。此外,五味子酮与头孢噻呋的联合使用对MRSA临床菌株表现出协同效果,FICI指数为0.1875-0.375。这一结果也在金葡菌诱导的小鼠肺炎感染模型中得到进一步证实。综上所述,五味子酮通过抑制Agr系统,降低溶血素的表达,减弱MRSA的毒力并防止耐药性的发展,它有希望成为对抗MRSA感染的新型候选化合物。此外,它还可作为一种佐剂与头孢噻呋联合使用,恢复头孢噻呋对MRSA的敏感性。本研究阐明了五味子酮抗感染的机制,同时,也为开发具有广泛临床应用前景的抗菌药物提供了新思路。