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研究背景我们的前期研究发现促胃肠动力药zacopride (5-HT4受体激动剂兼5—HT3受体拮抗剂)对大鼠心室肌内向整流钾电流(inward rectifier potassium current,IK1)表现出选择性增强作用,同时对大鼠心律失常模型表现出抗室性心律失常作用,但是其激动IK1通道的分子机制还远未阐明。已有报道显示,心房肌IK1上调或激动心房5-HT4受体都可能对心房电生理活动产生不利影响,导致心房纤颤等房性心律失常。尽管我们在研究zacopride激动心室肌IK1通道的实验过程未发现对心房电活动的不良影响,但zacopride已被证实是心肌选择性IK1激动剂和5-HT4受体激动剂,因此,不能排除它激动心房IK1通道或激活心房5-HT4受体,并导致潜在的致房性心律失常副作用的可能性。本研究旨在阐明zacopride对心房肌IK1的作用及激动心肌IK1的分子机制,将有助于深入研究IK1通道激动剂的抗心律失常作用及其潜在的临床应用价值。目前已知,构成IK1通道的亚单位主要来自Kir2亚家族(Kir2.x)中的Kir2.1、Kir2.2和Kir2.3,由它们构成同源及／或异源四聚体通道。编码Kir2.1、 Kir2.2和Kir2.3的基因分别是KCNJ2、KCNJ12和KCNJ4。鉴于不同种属和不同组织部位的IK1电流由不同Kir2.x亚型介导形成,而不同Kir2.x亚型又具有不同的电生理学特性,因此我们推测存在这样一种可能性,即zacopride对Kir2.x亚型的作用是具有选择性的,只针对某类亚型有激动效应,进而使zacoprid对Kir2.x亚型构成不同的大鼠心室肌和心房肌IK1产生不同效应,在抗室性心律失常的同时却不会影响心房的电活动。一般认为,包括Kir2.1、Kir2.2和Kir2.3在内的Kir2.x通道蛋白的磷酸化是IK1调节的重要机制,并主要涉及PKC和PKA信号转导系统。结合前期动物实验中,zacoprid未引发类似激动5-HT4受体和/或阻断5-HT3受体而导致的异常心电活动,我们推测zacoprid激动IK1是由对其敏感的Kir2.x亚型通道蛋白的磷酸化介导的,而非经5-HT受体途径。综上所述,本研究拟明确zacopride对大鼠心房肌IK1的作用；分析大鼠心室肌和心房肌IK1通道的Kir2.x亚单位构成和不同亚单位对zacopride激动效应的敏感性,并探讨这种激动效应的信号转导机制,以阐明zacopride激动IK1的分子机制目的1.了解zacopride对大鼠心房肌IK1的影响；大鼠心室肌和心房肌的Kir2.x亚型构成；明确zacopride对Kir2.1、Kir2.2和Kir2.3通道的作用。2.利用干预5-HT受体的工具药观测zacopride激动IK1的作用与细胞膜5-HT4受体和5-HT3受体的关系；利用干预PKA、PKC、PKG信号通路的工具药和基因突变技术分析zacopride激动其敏感Kir2.x通道的信号转导通路。方法采用胶原酶法急性分离大鼠心房肌细胞；利用全细胞膜片钳技术观察zacopride对大鼠心房肌细胞IK1电流和细胞跨膜电位的效应。运用Western blots分析大鼠心房肌及心室肌kir2.x通道构成。通过RT-PCR法获得的大鼠心肌Kir2.1、Kir2.2、和Kir2.3基因,并将Kir2.1基因进行点突变获得其磷酸化位点突变基因Kir2.1(S425L);将上述基因插入质粒pEGFP-N1将其转染HEK293细胞,构建大鼠心肌细胞Kir2.x异源表达系统。通过全细胞膜片钳技术了解zacopride对异源表达的大鼠心肌细胞kir2.x通道电流的效应,以及干预5-HT受体和干预PKA、PKC、PKG信号通路的工具药对zacopride调节IK1作用的影响。结果1.1μmol/L zacopride对大鼠心房肌细胞IK1电流、静息电位水平和动作电位幅度与时程均无显著作用。2. Kir2.1、Kir2.2和Kir2.3在大鼠心房及心室均有表达,Kir2.3表达量在大鼠心房及心室无明显差异,而大鼠心房Kir2.1表达量仅为心室相应量的25%,而Kir2.2在心房及心室的含量均较少。Kir2.1和Kir2.3分别是构成大鼠心室肌和心房肌的主要Kir2.x亚型。3.大约40%-60%瞬时转染后HEK293细胞表达绿色荧光蛋白,同时可记录到IK1电流,表明细胞模型构建成功。100p.mol/L zacopride可使HEK293细胞上表达的同源Kir2.1外向电流增加40.7%±9.7%(在-50mV，P<0.01),对内向电流无显著影响(在-110mV，P>0.05)。100μmol/L zacopride对同源Kir2.2、同源Kir2.3及异源Kir2.1+Kir2.2、Kir2.1+Kir2.3和Kir2.2+Kir2.3通道电流均无明显作用。表明100μmol/L zacopride只对HEK293细胞上表达的同源Kir2.1通道电流的外向部分有激动作用。4. HEK293细胞上未检测到5-HT3受体,5-HT4受体有少量表达。10μmol/L5-HT4受体拮抗剂RS23597-190不能消除100μmol/L zacopride激动Kir2.1电流的效应(P>0.05)。并且,同为5-HT4受体激动剂和5-HT3受体阻断剂的2-1-(4-Piperonyl) piperazinylbenzothiazole (PBT)(100μmol/L)不能激动反而抑制Kir2.1电流,使-110mV处内向电流减小31.4%±8.6%(P<0.05)。以上结果支持zacopride激动Kir2.1电流的效应与HEK293细胞的5-HT3受体和5-HT4受体的作用无关。PKA抑制剂KT5720能够显著抑制100μmol/L zacopride激动Kir2.1电流的效应(P>0.05),5.5μmol/L特异性PKC抑制剂GF109203X或5μmol/L特异性PKG抑制剂KT5823不能消除100μmol/L zacopride激动HEK293细胞表达的Kir2.1电流的效应(P>0.05),而5μmol/L特异性PKA抑制剂KT5720能够显著抑制100μmol/L zacopride激动Kir2.1电流的效应(P>0.05)。50μmol/L泉苷酸环化酶激活剂forskolin可使在HEK293细胞上表达的Kir2.1电流外向部分增大24.1%±5.9%(在-50mV, P<0.01);50μmol/L外源性环磷酸腺苷8-bromo-cAMP可使Kir2.1电流外向部分增大22.1%±1.9%(在-50mV,P<0.05)。替换Kir2.1PKA磷酸化位点S425生成的突变体Kir2.1S425L,对zacopride不敏感,100μmol/L zacopride在-50mV可使突变体电流增加13.3%±6.5%,但无统计学意义(P>0.05)。以上结果提示zacopride激动Kir2.1电流的效应是经AC/cAMP/PKA信号通路介导的。结论综合上述研究结果,我们得出以下结论：1. zacopride作为大鼠心室肌IK1选择性激动剂,对大鼠心房肌IK1却没有显著作用,对心房肌静息电位水平和动作电位幅度与时程均无明显影响。2. zacopride可激动HEK293细胞同源Kir2.1通道,而对同源Kir2.2、Kir2.3以及异源Kir2.1-Kir2.2、Kir2.1-Kir2.3和Kir2.2-Kir2.3通道均无显著作用。3.构成大鼠心室肌和心房肌IK1通道的亚单位组分不同,心室肌以Kir2.1表达为主,心房肌以Kir2.3为主,这是zacopride对大鼠心室肌和心房肌IK1具有不同作用的分子基础,为zacopride可选择性防治某些室性心律失常的作用提供了理论依据。4. zacopride增强Kir2.1电流通道的机制主要涉及激活AC/cAMP/PKA信号通路,而与其对5-HT3和5-HT4受体的作用无关,这与前期报道的zacopride增强心室肌IK1通道的作用机制是一致的。