血吸虫病流行广泛，危害严重。但由于其生活史的复杂性以及血吸虫在宿主体内发展了较强的免疫逃避机制等，目前尚没有可用于临床或现场的具有稳定的良好保护力的疫苗。血吸虫与宿主相互关系的分子机制亦待进一步研究。调控、自稳、自适应是生命体的本来属性，血吸虫依赖自身应激反应机制在面对各种胁迫因子及宿主机体防御攻击而维持自身稳定发育成熟，在这一过程中热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)应发挥着重要的作用。HSPs在许多生物体细胞进程和应激处理过程中作用关键，热休克反应是一种普遍的稳态机制，保护细胞和整个生物体面对环境压力的有害影响。有研究发现日本血吸虫在紫外致弱处理条件下，HSP70呈现显著上调趋势，而HSP90、HSP60呈现下调。血吸虫HSPs超家族内的协同效应及其机制，值得深入探讨。　　Sjp40是日本血吸虫主要虫卵抗原，呈现组成型表达，具有潜在的早期诊断价值。研究阐明曼氏血吸虫主要虫卵抗原P40(SmP40)隶属于具有α晶体蛋白结构域的小热休克蛋白sHSP20家族。sHSP(12000-43000)是HSPs超家族的重要成员，与细胞抗凋亡及生物体应激反应密切相关。这些HSPs基因在日本血吸虫抗胁迫维自稳中应扮演了重要的角色。本研究对HSPs进行生物信息学分析并通过浸泡法转染dsRNA进行RNA干扰以沉默日本血吸虫sHSP-Sjp40基因，探究其干涉效应及其对其他组成型高表达SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因的协同效应。　　一、日本血吸虫组成型高表达HSPs生物信息学分析及克隆表达鉴定　　目的：生物信息学分析日本血吸虫HSPs超家族中组成型高表达Sjp40、SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因，并进行克隆、表达、鉴定。　　方法：　　1.通过相关文献检索日本血吸虫转录组、蛋白质组数据库SjTPdb等找寻日本血吸虫组成型高表达HSPs基因。　　2.通过BLAST服务平台及MEGA4.0软件对Sjp40基因结构域及同源性进行分析，并构建进化树。　　3.通过ExPASy服务器中的ProtParam工具、SMART程序、Tmpred程序、PSORT程序等对SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90、Sjp40基因编码蛋白序列进行分析。　　4.以DNAMAN选取HSPs基因全长编码区域设计含酶切位点的引物扩增，得到纯化后的产物克隆到pET-32a(+)载体中，构建原核表达载体质粒，IPTG诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE分析。　　5.以抗Sjp40单抗6F10通过Western blot检测pET-32a(+)-Sjp40重组蛋白免疫反应性。　　结果：　　1.sHSP-SJCHGC06324/AY814158.1、HSP60-SJCHGC09129/AY813151.1、HSP70-SJCHGC06292/EZ000074、HSP90-SJCHGC00820/AY815927.1在日本血吸虫生活史各期转录组、蛋白质组中呈现高丰度组成型高表达情况。　　2.Sjp40隶属于具有α晶体蛋白结构域的小热休克蛋白sHSP20家族，同时检索已报道的曼氏血吸虫和日本血吸虫基因组、转录组、蛋白质组研究数据发现P40家族合计有39条高度同源均具有α晶体蛋白结构域的基因，其中具有完整读码框的cDNA有19条，并且Sjp40与SJCHGC06324蛋白序列高度同源。　　3.SjHSP60蛋白序列和SjHSP70蛋白序列二级结构主要以α螺旋为主;SjHSP90蛋白序列和Sjp40蛋白序列二级结构主要以无规则卷曲为主，而SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因编码蛋白均是跨膜蛋白，四种HSPs含有多个修饰位点及潜在的抗原表位。　　4.原核表达载体质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导后在大肠埃希菌中表达了重组蛋白。　　5.重组菌BL21(DE3)/pET-32a(+)-Sjp40以融合蛋白形式可溶性表达重组蛋白，Western blot显示重组蛋白具有良好的免疫反应性。　　结论：　　日本血吸虫生活史各期转录组、蛋白质组中有四种HSPs基因呈现高丰度、组成型、高表达状况。日本血吸虫主要虫卵抗原Sjp40隶属于小热休克蛋白家族，并且Sjp40与SJCHGC06324高度同源。SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因编码蛋白均是跨膜蛋白，并且含有多个修饰位点及潜在的抗原表位。Sjp40、SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因克隆到pET-32a(+)载体中获得诱导表达，抗Sjp40单抗6F10可识别重组表达的Sjp40。　　二、日本血吸虫小热休克蛋白Sjp40的RNA干扰效应探索　　目的：研究日本血吸虫小热休克蛋白(sHSP)Sjp40基因的RNA干扰（RNAi）效应及其干扰后日本血吸虫HSP60、HSP70、HSP90基因在mRNA水平出现的协同效应，观察各期虫体Sjp40、SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因mRNA表达水平。　　方法：　　1.设计两端含T7启动子PCR引物从尾蚴cDNA文库中扩增Sjp40基因和阴性对照GFP基因，扩增产物经切胶纯化后通过RNAi试剂盒体外转录直接纯化合成dsRNA。　　2.日本血吸虫尾蚴（湖南株）自阳性钉螺逸出，经腹部感染新西兰兔和BALB/c小鼠。并用盖玻片粘取液面尾蚴，机械断尾获取童虫。新西兰兔及小鼠于感染后42～45d剖杀，经门静脉灌注收集成虫，并收集虫卵。尾蚴、成虫及虫卵经PBS洗涤后备用。　　3.将获取的成虫用PBS(pH7.4)冲洗3次以上后转入RPMI1640培养基中（含10mM Hepes，10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素），置5％CO2培养箱37℃培养。　　4.通过浸泡法转染20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml dsSjp40及dsGFP，同时设立空白对照组。5％CO237℃培养7天后收集处理组及对照组成虫，PBS洗涤3次后备用。　　5.按TRIzol试剂说明书提取日本血吸虫尾蚴、成虫、虫卵及干扰后成虫总RNA，DNaseⅠ消化，逆转录成cDNA。实时荧光定量PCR检测Sjp40基因及SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因mRNA的表达。　　6.按TRIzol试剂使用说明提取成虫可溶性总蛋白(total soluble protein，TSP)。Western blot检测dsRNA处理后蛋白表达情况。　　7.统计学处理，用SPSS13.0统计软件进行统计分析，实验数据中计量资料以“均数±标准差”表示，用析因设计资料的方差分析方法进行检验，P＜0.05认为差异有统计学意义，显著性水准α=0.05，双侧。　　结果：　　1.Sjp40基因在第3d、5d、7d培养过程中其mRNA表达水平变化无显著性差异(P＞0.05)。　　2.以空白对照组为基线，与其相比不同RNAi剂量转染后Sjp40 dsRNA转染组中Sjp40基因的转录水平变化有显著性差异(F=24.301，P=0.001)，下降了80％以上，而GFPdsRNA转染组中Sjp40基因转录水平变化无显著性差异(P＞0.05);蛋白质水平较空白对照及阴性对照组(dsGFP)出现明显降低，qPCR结果显示在dsSjp40 RNAi后SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因的mRNA表达水平变化无显著性差异(P＞0.05)。　　3.转染后Sjp40 dsRNA转染组在相对分子量55000-70000处出现高表达的蛋白条带，是否是由于协同效应引起，有待进一步研究。　　4.Sjp40、SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90在日本血吸虫生活史不同时期mRNA表达存在显著性差异(P＜0.001)，Sjp40基因在虫卵期mRAN水平表达相对其他HSPs基因高。　　结论：　　dsSjp40 RNAi可特异性抑制Sjp40的表达，但对SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因mRNA的表达水平变化无显著性差异。