青光眼是以特征性视盘改变和进行性视野损伤为特征,最终引起视网膜视神经节细胞凋亡,导致视神经萎缩的不可逆转的致盲眼病。其中病理性眼压升高是最主要的危险因素,也是目前治疗青光眼过程中唯一可控因素。病理性眼压升高通常是由于小梁网处房水流出阻力增高所致。小梁网(trabecular meshwork, TM)位于前房角Schwalbe线与巩膜突之间的巩膜内沟处,是由小梁束相互交织形成的网状结构,每一束小梁由胶原纤维,弹力纤维及外面被覆的内皮细胞即小梁细胞组成,小梁细胞在调控房水外流,控制眼压过程中发挥重要作用。小梁细胞具有分泌、合成和降解等多种生理功能,其正常的形态结构对于维持眼内压至关重要。目前已有大量文献报道,小梁细胞的异常与青光眼的发生密切相关,但具体机制尚不明确,氧化应激和血管损伤被认为导致小梁网病理改变的两大主要因素。氧化应激是指体内产生的自由基超出机体的中和、消除能力,引起的一系列病理改变。生理条件下,活性氧的产生和消除处于平衡状态,而电离辐射,炎症或衰老等会打破上述平衡,发生氧化应激。而氧化应激可以导致多种急性与慢性病变,是许多疾病导致机体损伤的共同通路。氧化应激也与许多眼科疾病相关,例如：年龄相关性黄斑变性,白内障和青光眼。氯离子是生物体内含量最丰富的阴离子,其在全身各组织细胞都有广泛的表达。电压门控氯离子通道(voltage-gated chloride channel, ClC)是氯离子通道家族中的一员,而C1C-2氯离子通道是其中一个亚型,是目前研究最深入的一种电压门控氯离子通道,参与机体的多种生理、病例过程。研究表明电压门控氯离子通道在基地动脉平滑肌细胞氧化损伤的模型中具有一定的保护作用。在我们前期的研究中也发现,ClC-2氯离子通道参与视网膜色素上皮细胞,视网膜神经节细胞的增殖,迁移,凋亡等过程,并与小梁细胞骨架结构的维持密切相关。鉴于此,我们了设计以H2O2诱导TM细胞氧化损伤作为研究对象,观察ClC-2在TM细胞氧化损伤中的作用,并探讨其可能的机制。本研究中选用Sciencell购买的人原代小梁细胞(Human trabecular meshwork cells, HTM cell)。选用复苏后贴壁生长24小时的第3-5代HTM细胞进行实验。我们通过qRT-PCR, western bolt,细胞免疫荧光的方法从mRNA及蛋白水平验证了ClC-2在HTM细胞中的表达及定位胞浆。使用不同浓度H2O2作用于HTM细胞,筛选合适的造模条件,最终选定600μM用于后续实验。首先用含有600μM的H2O2的无血清培养基培养2小时,得到.HTM细胞氧化损伤模型。并分别应用cDNA转染技术和RNA干扰(RNA interfere, RNAi)技术来增强、敲除小梁细胞内C1C-2基因的表达。应用CCK-8法观察各组小梁细胞活性变化,应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率以及细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平变化,应用荧光显微镜检测各组线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential, MMP)的变化。我们发现600μM H2O2作用2h可以导致TM细胞活性下降,凋亡率增高,细胞内ROS增多,MMP电位下降。而cDNA转染技术过表达ClC-2后再给予H2O2,与单纯H2O2组相比,细胞活性增加,细胞凋亡率减少,细胞内ROS降低,MMP升高。相反,通过RNAi技术敲除ClC-2后再给予H2O2,与单纯H2O2组相比,细胞活性进一步下降,细胞凋亡率增加,细胞内ROS增多,MMP下降。以上实验从正反两方面证实,ClC-2氯离子通道对H202诱导的HTM细胞氧化损伤具有保护作用。即过表达ClC-2可以降低H2O2诱导的HTM细胞氧化损伤,而抑制ClC-2的表达则加重H2O2诱导的HTM细胞氧化损伤。线粒体凋亡通路是细胞凋亡的主要途径之一,也是TM细胞主要的内源性凋亡通路。其中Bcl-2基因家族对细胞凋亡的激活和调控起着关键作用。因此在进一步探索ClC-2对HTM细胞氧化损伤作用机制的过程中,我们分别观察了使用cDNA、RNAi技术增强、敲除HTM细胞内ClC-2基因表达后,各组细胞Bcl-2、Bax蛋白及活化的半胱天冬酶3 (caspase-3)表达情况。结果显示H2O2可以导致细胞Bcl-2表达降低,Bax及活化caspase-3表达增高。促进HTM细胞凋亡的发生。而cDNA转染后相比于单纯H2O2组Bcl-2下降幅度降低,H2O2及活化caspase-3升高幅度降低,而敲除C1C-2组呈相反趋势。这说明ClC-2对H2O2诱导的HTM细胞氧化损伤的保护机制可能与Bcl-2/Bax调控的线粒体凋亡通路相关。综上,本研究探讨了ClC-2在H2O2诱导的人小梁细胞氧化损伤中的作用。发现ClC-2在H2O2诱导的HTM氧化损伤过程中,能够起到保护性作用,即保护细胞活性,减少细胞凋亡率,降低细胞内活性氧增幅和维持线粒体膜电位的作用。Bcl-2/Bax调控的线粒体凋亡通路与这种保护机制相关。ClC-2可能为保护小梁细胞,控制眼压,抗青光眼的一个新靶点。