目的利用位点特异性重组技术(FullCoV技术)将中华蜜蜂幼虫膜蛋白cDNA连接到pPR3-N载体上,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,利用该文库,筛选与中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood bee virus,CSBV)结构蛋白VP2相互作用的宿主蛋白,为进一步研究中蜂囊状幼虫病毒VP2功能奠定基础。方法提取2~3日龄中蜂幼虫的总RNA,分离mRNA后,在反转录酶的作用下合成第一链的cDNA,并合成双链cDNA。在双链cDNA的5’端加上带有重组序列的接头后,通过FullCoV技术与载体pPR3-N进行连接,然后将连接产物电转化到感受态细胞(DH10B),构建中蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库,并对该文库插入片段大小和文库滴度进行检测。然后,将CSBV VP2基因分别克隆至pBT3STE和pBT3SUC载体,构建诱饵质粒pBT3STE-VP2和pBT3SUC-VP2,再将诱饵质粒pBT3STE-VP2和pBT3SUC-VP2分别转入酵母感受态细胞NMY32中,对其在酵母细胞中的表达功能及自激活能力进行检测。在此基础上,用25 mg的中蜂幼虫膜蛋白cDNA文库质粒与含有诱饵质粒的酵母感受态细胞进行融合,涂于SD-TLH缺陷型培养基上,于30℃培养72 h。然后,用PBS溶液冲洗所有菌落,转移至含有3 mM的3-氨基-1,2,4-三唑(3AT)的SD-TLH缺陷型培养基上继续培养72 h,再挑取单菌落稀释后分别涂至SD-TL和含有3 mM、10mM、40 mM、60 mM浓度3AT的SD-TLHA缺陷型培养基上进行培养,于30℃培养24h后,观察菌落生长状态。然后,挑取初步判定为阳性的克隆,利用pPR3N检测引物对菌落进行PCR检测。对扩增到特异性片段的酵母菌落提取酵母质粒,转化至感受态细胞(DH5α)中,提取质粒,再次进行PCR,将前后2次PCR条带相同的质粒进行测序。最后,对测序结果进行BLAST分析比较,推测可能与CSBV VP2互作的宿主蛋白。结果通过FullCoV技术成功构建了中蜂幼虫膜蛋白cDNA文库,经检测,中蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库的库容量为1.5×10~7 cfu,文库滴度为3×10~6 cfu/mL,重组率达到100%。对构建的诱饵质粒的表达功能及自激活能力的检测结果显示,两个诱饵质粒pBT3STE-VP2和pBT3SUC-VP2均能够在酵母细胞NMY32中表达且无自激活能力,其中诱饵质粒pBT3STE-VP2在酵母细胞表达能力优于pBT3SUC-VP2,故将其作为后续实验的诱饵质粒。将中蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库与含诱饵质粒pBT3STE-VP2的酵母细胞相互作用,结果显示在3AT浓度为60mM的SD-TLHA缺陷型培养基上,筛选得到58个阳性克隆,再经菌液PCR检测结果显示,其中有35个扩增出600~2500 bp之间的条带,将这35个阳性克隆的酵母质粒转化至DH5α中扩增后再经PCR进行检测,共获得25个前后2次PCR目的大小一致的质粒,进行测序。测序结果与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析,结果显示与CSBV VP2可能存在互作的宿主蛋白有12个,包括中华蜜蜂40S核糖体蛋白、中华蜜蜂60S核糖体蛋白、中华蜜蜂热休克蛋白70kDa、中华蜜蜂线粒体DNA、中华蜜蜂唾液分泌肽、中华蜜蜂易位相关膜蛋白、中华蜜蜂ATP合成酶脂质结合蛋白、中华蜜蜂重复序列结构域蛋白、中华蜜蜂丝氨酸精氨酸剪接因子、中华蜜蜂U6 snRNA相关蛋白、中华蜜蜂螺旋卷曲结构域蛋白、中华蜜蜂推测未定性的蛋白。结论1、利用FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库。2、构建的pBT3STE-VP2和pBT3SUC-VP2诱饵质粒在酵母细胞中无自激活能力,具有较好的表达功能,但诱饵质粒pBT3STE-VP2的表达能力优于pBT3SUC-VP2。3、通过中蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库与含诱饵质粒pBT3STE-VP2的酵母细胞相互作用初步筛选能够与CSBV VP2蛋白互作的宿主蛋白共有12个。