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烧伤在生产生活中经常发生,其中深II度烧伤很常见,其特点是创面肿胀苍白,常伴有水疱。与I度和浅II度烧伤不同,深II度烧伤须经医学处理才能愈合良好,其中烧伤敷料是最常用的治疗方法。敷料可提供创面适宜微环境,对创面愈合及后期修复起到关键作用,但目前还未有理想的烧伤敷料满足深II度烧伤创面愈合的多种需求,包括保护创面、吸收渗出、促进创面愈合、抗感染等。静电纺丝(Electrospinning)技术利用聚合物溶液或熔体在电场力下带电,并被拉伸产生形变,最终溶剂挥发固化形成纤维。静电纺丝纳米纤维的特点是尺度均一、长径较长。纳米纤维膜具有高孔隙率和高表面积体积比,与细胞外基质结构相似,适合作为创伤敷料。同轴纳米纤维具有壳核状或中空状结构,赋予纳米纤维特殊的性能。同轴纳米纤维的制备利用改进的静电纺丝工艺。该工艺采用不同的壳层溶液和芯层溶液,通过一个特殊的套管针头同时静电纺丝得到同轴纳米纤维。本文利用同轴静电纺丝技术,将具有强大吸水能力的海藻酸钠、广谱抗菌性能的壳聚糖、成纤维性良好的聚乙烯醇(PVA)及促伤口愈合的活性药物-积雪草总苷结合,制备得到芯层载积雪草总苷的海藻酸钠/PVA/壳聚糖同轴纳米纤维膜,并研究其对深II烧伤创面修复的促进作用。1.静电纺丝法制备同轴纳米纤维膜的处方工艺海藻酸钠与PVA混合作为同轴纳米纤维的壳层材料,芯层添加壳聚糖,筛选了同轴静电纺丝工艺中的电压、接收距离、壳层及芯层溶液浓度、推注速度等条件,最终确定同轴静电纺丝法制备纳米纤维的最佳处方及工艺参数:壳层为0.8%(w/v)海藻酸钠/7%(w/v)PVA混合溶液,芯层为3%(w/v)壳聚糖溶液;静电纺丝工艺参数:电压为23 k V,针头至接收屏的接收距离为15 cm,壳层及芯层推注速度分别为0.8、0.2 ml/h。扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)观察海藻酸钠/PVA/壳聚糖同轴纳米纤维膜表面光滑,串珠结构较少,平均直径为373.74±90.74 nm,分布均匀。2.同轴纳米纤维膜的结构及性能透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)观察同轴纳米纤维膜具有明显的核-壳结构,其中芯层直径为99.2 nm,壳层厚度为33.8 nm。X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)和傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectrum,FTIR)方法表征其结构,证明了同轴纳米纤维膜中各成分之间发生了一定的相互作用,形成了与物理混合物不同的内部结构。考察了同轴纳米纤维膜的吸水性能,证明加入海藻酸钠后能明显提高纳米纤维膜的吸水性能。加入壳聚糖增强了同轴纳米纤维膜抗菌性能。3.载药同轴纳米纤维膜的制备及释药在同轴纳米纤维膜处方工艺的基础上,制备芯层含积雪草总苷(积雪草总苷含量分别为1.5、2.5、5%,w/w)的载药同轴纳米纤维膜。扫描电镜观察载药同轴纳米纤维膜,纤维平均直径为433.37±75.47 nm,分布均匀,串珠结构少。高效液相色谱法测定积雪草总苷中单体成分积雪草苷含量,进一步计算载药同轴纳米纤维膜中积雪草总苷的含量。确定积雪草苷液相色谱条件为:高效液相色谱仪:安捷伦1260型;色谱柱Diamonsil?C18(5μm,250×4.6 mm);柱温:30℃;流动相:乙腈:水=29:71(v/v);检测波长:205 nm;流速:1.0 ml/min;进样量:20μl。建立积雪草苷标准曲线,回归方程A=4.6748C+4.585(r=0.9999),在10-400μg/ml范围内线性关系良好;5天内精密度良好,RSD<2%。表明该方法精确可靠,可用于积雪草总苷定量分析。载药同轴纳米纤维膜的体外药物释放结果表明其具有明显的药物缓释效果,同普通非同轴混纺纳米纤维膜相比,同轴纳米纤维膜释放缓慢,无药物突释现象,释药10h后,累积释放达到80%。经方程拟合,其释药机制符合Ritger-Peppas方程,证明药物释放以Fick’s扩散为主。4.载药同轴纳米纤维膜治疗深II度烧伤的药效学研究采用台式超级控温烧伤仪建立SD大鼠深II度烧伤模型,烧伤仪具体参数为:烫头温度80℃,压力500 g,烫头与皮肤接触时间8 s。创面组织学检查、创面愈合率及病理学结果表明,空白及载药同轴纳米纤维膜对大鼠深II度烧伤创面愈合均具有明显促进作用,伤后第18天创面已基本愈合,较模型组具有显著性差异,但未表现出明显的剂量依赖性。采用免疫组化、ELISA初步探讨同轴纳米纤维膜促进大鼠深II度烧伤创面的愈合机制,发现同轴纳米纤维膜可上调创面组织的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板-内皮细胞黏附分子(Cluster of differentiation 31,CD31)、增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)等细胞因子的表达,进而加速创面愈合。同时,同轴纳米纤维膜还可下调创面肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)等炎性因子的表达,减轻炎症反应,有利于创面愈合。载积雪草总苷同轴纳米纤维的成功制备为深II度烧伤治疗提供了新选择。