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目的:建立稳定表达乳腺癌耐药蛋白（Breast resistance protein,BCRP）的小鼠成纤维细胞系PA317/BCRP,进一步研究BCRP相关的耐药功能,初步探讨其耐药机制,为逆转其耐药提供依据。方法:首先,从表达BCRP的乳腺癌耐阿霉素细胞系MCF-7/Adr中,克隆出BCRP基因。将BCRP编码序列克隆入真核表达载体pcDNA3.1,转化感受态E.ColiDH5α,获得重组质粒pcDNA3.1/BCRP,酶切并测序鉴定。我们将测序正确的质粒用电穿孔法转染PA317细胞,同时转染pcDNA3.1/EGFP以观察转染率。G418筛选阳性克隆,有限稀释法获取单克隆后扩大培养。从G418筛选出的阳性转染细胞中提取细胞总RNA,RT-PCR法检测BCRP的mRNA表达,运用WESTERNBLOT法和免疫组织化学法检测BCRP蛋白在细胞膜上的表达。经验证正确的耐药克隆命名为PA317/BCRP,扩大培养并冻存。为验证其耐药功能,我们采用MTT法检测PA317/BCRP细胞对米托蒽醌（Mitoxantrone,MTZ）耐药性,罗丹明123外排实验验证转染后细胞外排罗丹明123功能,均以转染空质粒的PA317细胞及未转染细胞作为对照。此外,应用Western blot检测PI3K-AKT信号转导通路下游靶点AKT表达含量的变化,以初步探讨其细胞耐药机制。结果:成功构建质粒pcDNA3.1/BCRP,转染PA317细胞后经G418筛选,克隆化培养后获得两株抗药性细胞系。经RT-PCR法,Western blot和免疫组化法验证,均检测到细胞中BCRP基因转录及蛋白表达。遂将验证正确的细胞系命名为PA317/BCRP,扩大培养并冻存。与空质粒转染细胞、未转染细胞对照组相比,PA317/BCRP细胞对MTZ耐药性增强,且外排罗丹明123能力增强。耐药机制方面,我们经检测PI3K-AKT途径下游靶点AKT蛋白磷酸化水平在PA317/BCRP细胞内明显增高,其磷酸化AKT蛋白含量为PA317/pcDNA3.1细胞的10.87倍,为未转染PA317细胞的13.18倍。结论:1、成功获得稳定表达BCRP的PA317细胞系——PA317/BCRP,经MTT和罗丹明123外排实验证实,相对于转染空质粒和未转染的PA317细胞,其耐药和外排功能增强。该耐药细胞系的建立,为研究BCRP肿瘤多药耐药提供了研究平台。2、通过检测PA317/BCRP细胞PI3K-AKT途径下游靶点AKT的表达,我们观察到耐药细胞的AKT表达含量明显高于转染空质粒和未转染的PA317细胞。因此,我们认为BCRP可能通过影响AKT表达上调发挥其耐药作用,这为我们发现高效低毒的逆转剂提供了实验依据。