目的:辣木叶为辣木科辣木属植物辣木的叶子,属于域外药材,具有治疗便秘的传统应用。便秘是一种常见的消化道疾病,患病率随着年龄的增长而增加,严重影响患者生活质量。目前,关于辣木叶治疗便秘的研究较少。本实验利用正常小鼠、洛哌丁胺诱导的慢性便秘小鼠、低膳食纤维饮食诱导的慢性便秘大鼠,观察辣木叶促排便作用,利用无标记定量蛋白质组学技术研究辣木叶改善便秘的作用机制。方法:1.辣木叶水提物对正常小鼠的促排便作用:观察辣木叶给药1次和7次对正常小鼠排便数量、含水量的影响;观察给药7次后,对小鼠小肠炭末推进率及肝、肾、结肠组织形态的影响。2.辣木叶水提物对洛哌丁胺所致便秘小鼠的促排便作用:正常小鼠灌服15mg/kg盐酸洛哌丁胺3天,建立慢性便秘小鼠模型,以粪便数量评价模型成功与否。观察辣木叶水提物低(1.75g/kg)、中(3.5g/kg)、高(7 g/kg)剂量给药1次和7次对便秘小鼠排便数量、含水量的影响;给药7次后,进行小肠炭末推进率实验。3.辣木叶水提物对低膳食纤维饮食诱导的便秘大鼠的影响:饲喂低膳食纤维饲料建立便秘大鼠模型。辣木叶水提物低(0.625g/kg)、中(1.25 g/kg)、高剂量(2.5 g/kg)给药第7天收集大鼠粪便,记录大鼠体重、摄食量及粪便重量、数量和含水量;给药结束后取大鼠结肠及胃窦组织,HE染色和阿尔新蓝染色观察辣木叶对大鼠结肠组织的影响;ELISA检测胃窦中Gas、MTL含量及结肠中VIP、SP、NPY的含量。4.Lable-free蛋白质组学研究:大鼠结肠组织经裂解制备受试样本,采用LC-MS/MS联用技术进行分析检测。在Proteome Discovery version2.2.0.388蛋白质组学处理平台,使用Mascot搜索引擎在UniProt大鼠蛋白质数据库上搜索碎片,对蛋白质进行鉴定;通过峰面积法对蛋白进行定量。将定量后的蛋白质数据利用SPSS软件进行数据处理,P<0.05为差异表达蛋白。利用Gene Ontology数据库对差异表达蛋白进行生物学过程、细胞成分、分子功能注释和信号通路富集分析。Uniprot及String数据库用于解释差异蛋白的功能和相互作用关系。5.Western blot验证候选差异蛋白的表达:对“5-HT1型受体介导的信号传导途径”和“毒蕈碱乙酰胆碱受体-2和-4信号传导途径”中的Vamp2、Gnai3、Prkacb蛋白进行验证。结果:1.给药1次后,辣木叶高、中、低剂量组小鼠所排黑色粪便数及粪便含水量显著高于正常对照组(P<0.05);低剂量显著增加小鼠排便总数(P<0.05)。给药7次后,辣木叶高、中、低剂量组小鼠所排黑色粪便数较正常对照组显著增加(P<0.05);中、高剂量组小鼠的粪便含水量显著增加(P<0.05)。在小肠炭末推进率实验中,高剂量小鼠的小肠炭末推进率显著增加(P<0.05)。HE结果显示,辣木叶水提物低、中、高剂量对正常小鼠的肝、肾、结肠组织影响较小。2.正常小鼠洛哌丁胺造模3天后,粪便总数显著低于正常对照组(P<0.05),证明便秘模型已建立。便秘小鼠灌服辣木叶水提物1次后,小鼠所排黑色粪便数及黑色粪便含水量较模型组显著增加(P<0.05)。给药7次后,辣木叶对小鼠的排便没有明显改善作用。小肠炭末推进率实验显示,与模型组比较,辣木叶高、中剂量显著增加便秘小鼠的小肠炭末推进率(P<0.05)。3.低膳食纤维饮食饲喂大鼠21天后,与正常对照组比较,大鼠粪便数量、重量、含水量均显著降低(P<0.05)。造模成功后,大鼠灌胃给予辣木叶水提物7天,与模型组相比,辣木叶水提物中、高剂量可显著增加粪便含水量(P<0.01)。HE和阿尔新蓝染色显示,辣木叶给药组大鼠结肠部位肌层厚度和黏蛋白的分泌有所增加,但不具有显著性。ELISA结果显示,与模型组比较,辣木叶的中、高剂量显著增加大鼠胃窦中的Gas、MTL和结肠中的VIP、SP的含量(P<0.01)。4.结肠部位的蛋白质鉴定和定量后,共有3575个蛋白被识别和定量化,其中1731个蛋白表达具有显著性差异(P<0.05)。Gene Ontology分析后,1731个差异表达蛋白共涉及116个生物过程、78个细胞成分、75个分子功能和15条信号通路。所鉴定的蛋白质多为胞浆蛋白,涉及细胞代谢、蛋白质合成等多种生物学过程,具有催化活性、水解酶活性、核酸结合活性等功能。在15条信号通路中,多巴胺受体介导的信号通路(P05912)、尼古丁药效学途径(P06587)、Beta2肾上腺素受体信号传导途径(P04378)、Beta1肾上腺素能受体信号通路(P04377)、泛素蛋白酶体途径(P00060)、5-HT1型受体介导的信号通路(P04373)、帕金森综合症(P00049)、毒蕈碱型乙酰胆碱受体2和4信号通路(P00043)、亨廷顿病(P00029)这9条信号通与胃肠道运动和肠液分泌相关,为辣木叶治疗便秘的相关作用信号通路。由于5-HT和Ach是肠神经系统中重要的神经递质,对便秘的发生与治疗非常重要。本研究对5-HT受体和Ach受体所介导的信号通路深入分析,发现5-HT和Ach通过GPCR-cAMP-PKA途径作用于K+与Ca2+通道,与肠液的分泌和肠道运动相关,可能为辣木叶治疗便秘的信号通路。5.Western blot法对“5-HT1型受体介导的信号通路”和“毒蕈碱型乙酰胆碱受体2和4信号通路”中的差异表达蛋白Vamp2、Gnai3、Prkacb的进行验证,结果发现Vamp2、Gnai3、Prkacb在模型组中表达均下降,在辣木叶低剂量组中均增加,与蛋白质组学检测结果基本一致。结论:1.辣木叶水提物可改善便秘引起的结肠组织变化,增加结肠肌层厚度和黏蛋白分泌;同时影响便秘大鼠胃窦及结肠组织内胃肠激素的含量,通过促进结肠运动与分泌,发挥促排便作用。2.蛋白质组学结果表明,辣木叶可通过5-HT1型受体介导的信号通路、毒蕈碱型乙酰胆碱受体2和4信号通路、多巴胺受体介导的信号通路、尼古丁药效学途径、肾上腺素受体信号传导途径、泛素蛋白酶体途径、帕金森综合症途径和亨廷顿病途径发挥治疗作用。Western blot进一步验证5-HT和乙酰胆碱受体所介导的GPCR-cAMP-PKA途径中的差异表达蛋白Vamp2、Gnai3、Prkacb,验证结果与蛋白质组学实验结果一致,表明辣木叶可通过这两条信号通路发挥治疗便秘的作用。