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目的：探讨氨茶碱(aminophylline)对体外培养的大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)增殖抑制和促凋亡作用及其与基质金属蛋白酶(MMP)、c-fos的关系，在细胞和分子水平为氨茶碱治疗哮喘提供理论依据。方法：以含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液培养大鼠ASMC，第4—6代细胞用于实验，细胞用不同浓度氨茶碱(0、50、100、200、300、400mg/L)处理，采用细胞计数法及MTT法观察并比较不同浓度氨茶碱对培养细胞的增殖抑制作用；RT-PCR半定量检测细胞c-fos mRNA的表达；明胶酶谱和Western blot检测细胞MMP2、MMP9的活性及表达：用苏木精/伊红(HE)及吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色，光学显微镜和荧光显微镜观察细胞凋亡形态学改变，并计算凋亡百分率；用琼脂糖凝胶电泳分析DNA片断。 结果：MTT法及细胞计数法观察到：100mg/L以上浓度氨茶碱对体外培养大鼠ASMC增生具有明显的抑制作用(p＜0.05)，随着药物剂量的增大，其抑制作用增强，且呈时间—剂量依赖效应。RT-PCR可见各组细胞均有c-fos表达，即371bp处电泳区带。氨茶碱作用后，c-fos表达量减少，呈剂量依赖效应。Western blot和明胶酶谱结 第四军医大学硕士学位论文果显示:含10%胎牛血清的细胞培养液内，有MMPZ、MMPg表达，50、100、20Omg/L氨茶碱作用4Sh后，细胞培养液内MMPZ蛋白水平分别为3.70士0.28、3.58士0.27、3.37士0.25，较对照组(3.83士0.30)显著降低(p<0.05)，且呈剂量依赖效应;其中，100、20Omg/L氨茶碱作用后，较对照组降低非常显著(p<0.01);MMPg蛋白水平分别为0. 19士0.04、0.16士0.02、0.13士0.02，亦较对照组(0.21士0.06)显著降低(p<0.05)，也呈剂量依赖效应:其中，100、200mg/L氨茶碱作用后，较对照组降低非常显著(p<0.01)。氨茶碱作用48h后明胶酶活性亦明显降低，相应氨茶碱浓度细胞培养液内MMPZ降解明胶面积(mm，)分别为6.17士0.52、4.70士0.30、3.98士0.42，较对照组(6.58士0.35)显著降低(p<0.05)，且呈剂量依赖效应:其中，100、200mg/L氨茶碱组较对照组降低非常显著(p<0.01);MMP一9降解明胶面积(mm，)分别为0.23士0.02、0.17士0.02、0.12士0.02，与对照组(0.25士0.02)比较，亦有显著差异(p<0.05)，且也呈剂量依赖效应:其中，100、200mg/L氨茶碱组较对照组有非常显著的差异(p<0.01)。HE染色后，光学显微镜观察到:正常大鼠ASMC呈梭形，胞浆及细胞核淡染，而凋亡细胞胞浆浓缩，体积缩小，细胞核致密、浓染，可有凋亡小体形成。对照组ASMC大多数为正常细胞，内有少量凋亡细胞;氨茶碱作用后，正常细胞减少，凋亡细胞增多，凋亡小体形成。AO/EB染色后，荧光显微镜下细胞形态与光学显微镜下一致，但胞质和胞核发绿色及亮黄绿色荧光;凋亡细胞胞质及胞核内有橙红色荧光。并有染色增强，荧光亢进、均匀一致的凋亡小体形成。经拍照计数观察到:随着氨茶碱浓度的增高，细胞凋亡百分率增高，10Omg/L氨茶碱作用24h后，凋亡百分率达29%，较对照组有显著差异(p<0.05)。ZOOmg/L氨茶碱作用24h后，凋亡百分率达40%，较对照组有非常显著差异(p<0.01);琼脂糖凝胶电泳观察到氨茶碱处理后，ASMC的DNA呈现凋亡细胞特有的典型梯状区 第四军医大学硕士学位论文带:而对照组DNA双链完整，聚集于尾部，无凋亡带出现。结论:氨茶碱以时间一剂量依赖效应抑制体外培养的大鼠ASMC增生，表明氨茶碱可以通过抑制ASMC增生，参与气道重塑的治疗;氨茶碱以剂量依赖效应抑制大鼠ASMC的c一fos mRNA表达，并可能通过抑制c一fos的表达来抑制大鼠ASMC增生，从而为氨茶碱治疗气道重塑提供分子机制;氨茶碱以剂量依赖效应抑制大鼠ASMC中MMPZ、MMPg的活性及蛋白表达，从而抑制气道平滑肌细胞增生，参与气道重塑的治疗;氨茶碱可以诱导体外培养的大鼠ASMC凋亡，表明氨茶碱不但可以通过抑制ASMC增生直接参与气道重塑的治疗，而且可以通过诱导细胞凋亡，在细胞水平消灭炎性介质来源，间接参与气道重塑的治疗。总之，研究表明，氨茶碱可通过各种途径参与哮喘气道重塑的治疗。