目的：血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）的增殖和肥大是高血压、动脉粥样硬化等血管重塑性疾病的病理学基础。肾素-血管紧张素系统的激活以及由此产生的血管紧张素（angiotensin，Ang）II在心血管疾病的发生发展中起着重要作用。活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）作为重要的信号分子参与介导了Ang II引发的诸多病理生理过程。VSMCs是血管ROS生成的主要来源，NADPH氧化酶是催化ROS生成的关键酶，其活性受p47phox亚基的调节，后者在Ang II诱导的VSMC ROS合成中扮演重要角色。在心血管系统中，Ang II引发的分子和细胞事件几乎都是通过血管紧张素II1型受体（angiotensin II type1receptors, AT1R）介导的。作为AT1R下游的信号分子，蛋白激酶C（PKC）是Ang II诱导的诸多胞内信号途径交互联系的关键枢纽，含有多种亚型。其中， PKCδ是大鼠VSMC表达的主要亚型之一。然而其在Ang II诱导的ROS生成中的作用尚不明确。有关血管氧化应激的调节机制已有很多理论观点，但是功能性蛋白在调控VSMC ROS合成中的作用和分子机制研究尚少。平滑肌22alpha（smooth muscle22alpha，SM22α）是一种actin相关蛋白，特异表达于成熟的SMC中。近期的研究表明，SM22α缺失可通过激活ROS介导的NF-κB途径而参与血管炎症反应。但其激活ROS产生的作用机制尚不清楚。方法：本文假设，SM22α功能失调可能参与Ang II诱导的血管氧化应激。本研究从分子、细胞和整体水平上，考察Ang II对VSMCs中SM22α表达和功能的影响，以及与ROS生成、VSMC增殖和肥厚的关系；利用蛋白质相互作用分析技术，探讨SM22α对PKCδ-p47phox通路激活的影响及信号调节机制；进而，分别用血管肥厚模型和内膜增生模型验证体外研究的发现。旨在为血管重塑性疾病的发病机制提供新的理论依据，为心血管疾病的防治提供新的靶点。结果：1SM22α表达下调加剧Ang II诱导的VSMC氧化应激1.1Ang II引发的SM22α表达下调促进ROS的合成Western blot结果表明，Ang II以时间依赖方式抑制SM22α表达，24h时抑制作用最强。DHE染色和TBA分析结果表明，AngII诱导的ROS合成呈现双峰模式，峰值分别出现在0.5-1h和24h。利用小干扰RNAsiSM22α特异性敲低VSMC内源性SM22α后，ROS合成增加，而利用腺病毒Ad-GFP-SM22α感染VSMCs使外源性SM22α过表达后，ROS合成下降。结果表明，Ang II引发的SM22α表达下调促进了VSMC ROS的合成。1.2SM22α表达下调促进Ang II诱导的p47^phox激活免疫沉淀结果显示，Ang II刺激VSMCs10min，p47^phox磷酸化达峰值；免疫荧光和亚细胞组分分离结果显示，Ang II短时刺激可诱导胞浆p47^phox发生膜转位。提示参与Ang II诱导的ROS合成。进一步分析显示，敲低SM22α可促进Ang II诱导的p47^phox磷酸化，而过表达SM22α抑制该过程。结果表明，SM22α表达下调通过促进p47^phox激活而增强Ang II诱导的ROS合成。2Ang II诱导的SM22α磷酸化是PKCδ-p47^phox轴激活所必需的2.1磷酸化SM22α介导PKCδ与p47^phox的相互作用为了揭示SM22α在Ang II诱导的p47^phox快速磷酸化中的作用，基于SM22α分子中存在的三个可能磷酸化位点，首先检测了Ang II短时刺激对SM22α磷酸化的影响。免疫沉淀结果显示，Ang II刺激10-30min时，SM22α磷酸化水平达到峰值。随后，分别利用SM22α野生型、强制磷酸化突变体S181D、和磷酸化失活突变体S181A腺病毒感染细胞，结果显示，SM22α和S181A，而不是S181D显著抑制Ang II短时刺激引发的p47^phox磷酸化和膜转位，提示SM22α S181磷酸化有利于p47^phox活化。为了阐明SM22α调控p47^phox活性的分子机制，进而检测SM22α与p47^phox和PKCδ的相互关系。免疫共沉淀结果显示，静息状态下，SM22α与PKCδ结合。Ang II刺激10min后，随着PKCδ磷酸化激活，其与SM22α解离，转而与p47^phox相互作用，伴随发生SM22α和p47^phox磷酸化。免疫双荧光定位分析也证实了这一点。为了证实SM22α磷酸化促使其与PKCδ解离，分别将野生型SM22α和磷酸化位点突变体S181D，S181A转染293A细胞。免疫沉淀结果显示，PKCδ与S181A的亲和力明显高于S181D；过表达SM22α或S181A，可明显抑制PKCδ与p47^phox的相互作用。GST-pull down结果进一步证实了上述发现。为了确定SM22α在Ang II长效刺激诱导的氧化应激中的作用，用Ang II处理VSMC24h，或利用siRNA敲低内源性SM22α，观察对p47^phox活性的影响。免疫沉淀结果表明，Ang II长效刺激或敲低SM22α表达均促进PKCδ与p47^phox相互作用和p47^phox激活。结果表明，SM22α Ser181磷酸化或表达下调分别参与AngII诱导的快速和迟发的氧化应激，其作用机制与促进PKCδ-p47^phox途径激活有关。2.2AT1R-PKCδ途径介导Ang II诱导的SM22α S181磷酸化为了揭示介导SM22α S181磷酸化的上游信号通路，分别以AT1R拮抗剂缬沙坦、PKC激动剂佛波酯和抑制剂十字苞碱、PKCα/β选择性抑制剂G6976、PKCδ选择性抑制剂Rottlerin或PKCδ特异性小干扰RNA处理VSMCs。结果显示，AngII通过AT1R激活PKCδ，后者参与介导了Ang II诱导的SM22α S181磷酸化。上述发现表明，SM22α是PKCδ的一个新的作用底物。2.3SM22α下调可通过细胞骨架动力学而促进PKCδ-p47^phox轴激活为探讨SM22α调制Ang II长效刺激诱导ROS生成的作用机制，本研究首先考察Ang II长效刺激对SM22α泛素化降解的影响。免疫沉淀结果表明，Ang II能以时间依赖的方式促进SM22α泛素化，4h时泛素化水平最高。PKCδ选择性抑制剂Rottlerin可明显削弱Ang II引发的SM22α泛素化；重组腺病毒感染分析显示，与S181D相比， S181A显著抑制Ang II诱导的SM22α泛素化；293A细胞株转染分析得到相似的结果。上述发现表明，AngII通过诱导SM22α磷酸化而加速其泛素化降解。为了确定SM22α缺失对细胞骨架动力学的影响，分步提取G-actin和F-actin，Western blot结果显示，Ang II刺激VSMCs24h后，随着SM22α水平的降低，F-actin/G-actin比值下降，表明Ang II长期刺激能促进细胞骨架解聚。为了进一步证实细胞骨架动力学对ROS合成的影响，分别以细胞松弛素B处理VSMCs。免疫沉淀结果表明，细胞骨架解聚促进PKCδ-p47^phox轴激活以及p47^phox的活化，而细胞骨架稳定剂JPK抑制了该过程。结果表明，Ang II长效刺激导致的SM22α下调可通过加速细胞骨架解聚而促进PKCδ-p47^phox轴激活和ROS生成。3SM22α磷酸化介导的ROS生成参与VSMC肥大和增殖的调节3.1SM22α磷酸化与VSMC增殖和肥大成正相关关系5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）掺入和单位细胞蛋白含量分析结果显示，SM22α磷酸化促进Ang II诱导的VSMC增殖和肥大；反之，抑制SM22α磷酸化，则可在一定程度上降低细胞增殖和肥大活性。3.2SM22α磷酸化在血管肥厚和内膜增生中发挥重要作用将含有Ang II的Alzet微渗透泵植入大鼠皮下，持续给予Ang II刺激，建立大鼠高血压模型；同时，在体颈总动脉分别导入SM22α、S181D和S181A，观察对Ang II诱发的血管肥大和ROS生成的影响。模型成功后，取颈总动脉切片，HE染色结果显示，Ad-GFP-SM22α和Ad-GFP-S181A组的血管中膜增厚及横截面积增大程度明显减弱；免疫组化染色可见，氧化应激的标志物4-HNE也明显减少。结果表明，过表达SM22α或抑制其磷酸化可抵抗Ang II诱发的血管肥大及ROS合成。利用大鼠颈总动脉球囊损伤模型，同样发现过表达SM22α和非磷酸化突变体S181A可抑制球囊损伤诱导的血管ROS合成及新生内膜形成。总之，SM22α通过调制氧化应激而在VSMC肥大和增殖中发挥关键作用。靶向SM22α Ser181磷酸化可能是预防高血压和血管成形术后再狭窄的新的药物靶标。结论：1SM22α表达下调促进Ang II诱导的VSMC氧化应激。2Ang II诱导的SM22α磷酸化是激活PKCδ-p47^phox轴所必需的。3SM22α通过调制氧化应激而在VSMC肥大和增殖中发挥关键作用。