背景与目的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见及预后最差的的恶性肿瘤之一。根据统计,全球每年新发肝癌患者约六十万,发病率居恶性肿瘤的第五位,死亡率占恶性肿瘤的第三位。目前肝癌的治疗方式多种多样,其中手术是治疗肝癌的主要手段,但是手术等方法治疗后的高复发率和高转移率导致肝癌治疗困难,患者总体预后很差。HCC是一种高度血管化的肿瘤,是典型的富血管肿瘤,其恶性生物行为与肿瘤血管组织丰富密切相关,并且肝癌极易侵袭包膜和血管,导致局部扩散和远处转移。尽管目前对肝癌的增殖调控有较多研究,但是通过血管增生而促使肿瘤转移及其分子机制尚不清楚。因此,深入探讨肝癌血管增生对肿瘤增殖转移的机制,探寻新的诊断治疗靶点非常迫切。URG4(上调基因4,也称为URGCP)是近期发现的可以被乙肝病毒X(hepatitis B Virus x,HBx)蛋白上调的基因,它位于染色体7p13,最初是被Tufan等人发现和阐述的。有实验表明,在乙型肝炎病毒抗原(HBxAg)阳性时,JRG4/URGCP水平上调,会促进肝细胞的生长和存活,进而发展为肝癌细胞。在肝癌和胃癌患者中URG4/URGCP水平上调,而URG4/URGCP可以促进肝癌细胞和胃癌细胞的增殖和致瘤性。基于这些发现,一直有观点认为,URG4/URGCP在多种肿瘤中可能起到原癌基因的作用。然而,在肝癌细胞中,URG4/URGCP对肿瘤血管增生的影响尚未阐明。URGCP/URG4通过血管增生促进肝癌的进一步恶化鲜有报道。近年来发现,血管增生是肝细胞癌发生发展的必要条件。高水平的血管增生与不良预后、HCC高度侵袭性表型有关。肿瘤血管形成不足会导致肿瘤细胞的坏死或凋亡,肿瘤生长受抑制。然而单纯的调节血管生成因子的活性本身不足以抑制血管的生长,而需要与血管生长的负调节因子或抑制剂共同作用才可较有效的抑制血管形成。目前应用较多的抑制血管形成的抑制剂有管抑素、内皮抑素、干扰素、血小板因子4等,但这些分子仅针对内皮细胞生长,无法抑制或消除肿瘤细胞的生长。因此寻找一个直接靶向调控肝细胞癌血管生成的分子成为目前最为迫切的问题。人们普遍认为HBV病毒的X蛋白(HBx)对病毒的复制和HCC的发生起主要作用。在HBV相关的HCC,病毒的HBx蛋白已被确认为一个增强细胞的增殖和存活的重要因素,作为一种反式激活因子在乙型肝炎病毒感染的肝细胞中,HBx蛋白已发现有助于转录调控一些下游基因如JRG4,7.11,12and19。URG4/URGCP前期发现在肝癌细胞HepG2激活促进细胞生长,同时研究结果显示URG4/ URGCP高表达时,临床预后效果差,这显示URG4/URGCP与肝癌形成有密切相关。在骨肉瘤组织中URG4/URGCP基因的过表达与肿瘤的复发、转移以及骨肉瘤细胞的增殖活性有关,这表明URG4/URGCP基因对某些肿瘤是有价值的预后标志物。Xie C等报道了URG4/URGCP基因在HCC细胞和临床组织中过表达,并与Ki67的表达呈正相关,URG4/URGCP基因高表达的细胞系具有较强的增殖和转移能力,且URG4/URGCP基因的高表达促进FOX03a蛋白的磷酸化使其失活,从而促进细胞增殖和转移。许多恶性肿瘤的预后都比较差,其中一个重要原因是肿瘤可以通过释放一些细胞因子促进血管的生成,使肿瘤往远处浸润和转移成为可能。Ji GZ等研究发现HCC组织比癌旁组织过表达TGF-β1、Smad7以及具有较高的微血管密度,而TGF-β在许多肿瘤细胞中也能介导TNFκB(核因子活化B细胞K轻链增强子)的活化。NF-κB是促炎症基因表达的重要转录因子,可调节细胞分泌IL-6, IL-1和TNF-α等分子。Lai HS等在肝癌小鼠模型中研究发现IL-6可促进血管紧张素的释放通过JAK/STAT3和JAK/p38/NF-κB通路促进血管生成。NF-κB作为一个转录因子,它在肿瘤增殖、转移和血管增生过程中扮演着重要角色。在HCC中常发现NF-κB表达上调,并通过ERK/NF-κB促进MMP9和VEGF表达。NF-κB激活对TGF-β/Smad7、JAK/STAT3、AKT/NFKB,NFKB/STAT3等信号的网络调控尚不清楚。有研究发现URG4/URGCP可以诱导NF-κB高表达,URG4/URGCP在肝癌中对细胞信号通路的激活及对肝癌血管生成的影响有待进一步探讨。基于上述背景,本文研究目的即：(1)探索URG4/URGCP是否通过激活NF-κB信号通路来促进肝细胞癌血管增生及其可能的分子机制。(2)探讨URG4/URGCP是否有可能成为肝细胞癌诊断治疗的潜在靶分子。方法通过蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR实验检测URG4/URGCP在HCC细胞系和正常肝上皮细胞系的表达。使用脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管生成、迁移实验及鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验来检测URG4/URGCP过度表达或敲除的细胞系的血管生成能力。用荧光素酶报告方法来检测NF-κB的转录活性。使用过度表达抗降解的NF-κB抑制剂IκBa突变体来抑制NF-κB的活性。采用实时荧光定量PCR检测VEGFC,TNF-α,IL-6,IL-8和MYC的表达水平。采用ELISA法检测VEGFC蛋白表达水平。具体方法如下：1、载体构建、逆转录病毒包装和转染。用PCR扩增人类全长的亚克隆URG4/URGCP序列并克隆到pMSCV-retro-puro载体中形成URG4/URGCP表达载体。为了敲除URG4/URGCP基因,使用针对人URG4/URGCP基因的序列的siRNA,将其克隆到pSuper-retro-puro质粒上形成URG4-Ri。逆转录病毒生成和感染参考Hahn等(Mol Cell Biol.2002)报道的方法。URG4/URGCP表达载体、URG4-Ri载体及NF-κB抑制剂表达载体pBabe-Puro-IκBα-mut[可生成抗降解的κB抑制剂(IκB)-α突变蛋白(IκBα-mut)]利用脂质体包埋法(脂质体2000瞬间转染)转入HCC细胞。2、实时荧光定量PCR检测URG4/URGCP、VEGFC, TNF-α, IL-6, IL-8和MYC的表达水平。用TRIzol试剂提取细胞总RNA,取2μg RNA利用随机引物合成cDNA。实时荧光定量PCR在ABI 7500上进行。步骤为：预变性95℃,10min,接着进行28个PCR循环包括95℃ 60s,58℃ 30s,72℃ 30 s,最后72℃ 5min。目的基因的表达水平采用与内参GAPDH比较的相对法计算,公式为2-[(Ct of Genes)-(Ct of GAPDH)]。3、蛋白免疫印迹检测URG4/URGCP等蛋白表达。提取细胞总蛋白并在100℃加热5min。取20μg蛋白利用SDS-PAGE电泳分离,PVDF膜电转,脱脂奶封闭后利用多克隆兔抗URG4抗体,抗IKK抗体,抗pIKK抗体,抗IκBa抗体或抗p-IκBα抗体进行杂交,剥胶后利用α-Tubulin抗体再杂交作为上样对照。4、HUVEC血管生成实验。24孔板中每孔加入200μl基质,37℃聚合30分钟。吸取HCC细胞系培养液上清,与HUVECs混合,制成细胞悬液,吸取200μl(约含HUVECs2×104)加入每孔,37℃,5%CO2孵育24h。光学显微镜放大100倍拍照,毛细血管的生成能力通过测量每张图片的毛细血管生成数来进行定量分析。5、鸡胚尿囊膜(CAM)实验。CAM实验使用8天龄的受精鸡蛋。每个蛋壳表面开个1 cm直径的孔,去除外壳膜以暴露CAM。在CAM上放置0.5cm直径的过滤纸,将100μl从HCC细胞系培养液中收集的CM(条件培养液)或从加入空载体的对照细胞中收集的CM加到滤纸的中间。鸡蛋在37℃、相对湿度80-90%环境下培养48h,然后用灭菌绑带把孔封闭上。接着用固定液(甲醇1：1丙酮)固定15Min后,对CAM进行离体并用数码相机拍照。实验组中二级和三级血管的数量通过与对照组比较算出相对值。6、HUVEC transwell迁移实验。HUVECs与含5%FBS的CM混合,把约1 ×104 HUVECs加到聚碳酸酯材料的transwell过滤器的上部。下部的室中加入500m含15%FBS的培养基。在37℃孵育20h,把迁移到下层膜表面的细胞用4%多聚甲醛固定,苏木精染色15min,对10张随机选择的200倍视野下的滤纸进行计数,并与对照组比较计算出相对值。7、荧光素酶报告分析NF-κB转录活性。用pNF-κB-荧光素酶报告和对照载体来检测NF-κB的转录活性。加三份1.5×104 HCC细胞到24孔板中贴壁生长,用脂质体2000将100ng荧光素酶报告载体或对照载体及lng pRL-TK Renilla载体共转染。荧光素酶和Renilla信号在转染48h后利用双荧光素酶报告方法试剂盒进行测定。8、酶联免疫吸附实验检测VEGFC蛋白表达。VEGFC酶联免疫分析法按试剂盒说明进行操作。标准溶液,标本和阴性对照分别加到板中,均做3个复孔。36℃孵育90分钟,洗板,加特异性anti-VEGFC抗体36℃孵育1小时,洗板,加二抗孵育1小时,加底物孵育1小时,OD450读取吸光度。9、统计学分析。所有实验数据均来自三个独立的重复实验。采用成组设计两样本均数比较的t检验来比较实验组和对照组各指标间的差异。当两组间方差不齐时,则采用t’检验。所有定量指标均采用均数±标准差表示,以α=0.05为检验水准,采用双侧检验。数据库的建立和数据处理均使用SPSS 16.0统计学分析软件。结果1、在肝癌细胞株中URG4/URGCP蛋白质和mRNA的表达显著上调。各肝细胞系中URG4/URGCP蛋白表达的免疫印迹实验中,相对于正常肝表皮细胞系L02,7种HCC细胞系(Hep3B、MHCC-97H、HepG2、SMMC-7721、 QGY-7703、Huh7、Bel-7402)中URG4/URGCP蛋白表达显著上调,各实验组与对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.01)。在肝癌细胞系和正常肝细胞中URG4/URGCP mRNA表达的实时定量PCR实验中,相对于正常肝表皮细胞系L02,7种HCC细胞系中URG4/URGCP mRNA显著上调,各实验组与对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.01)。2、过度表达URG4/URGCP促进HCC细胞的血管增生和VEGFC的表达。URG4/URGCP蛋白表达的免疫印迹实验中,实验组(URG4/URGCP肝癌细胞系QGY7703和Hep3B)中URG4/URGCP蛋白表达水平均高于对照组(Vector肝癌细胞系QGY7703和Hep3B),差异均具有统计学意义(P<0.05)。在人类脐静脉内皮细胞血管生成实验中,实验组(URG4/URGCP肝癌细胞系QGY7703和Hep3B)中人类脐静脉内皮细胞血管生成数量均大于对照组(Vector肝癌细胞系QGY7703和Hep3B),差异具有统计学意义(P<0.05)。在人类脐静脉内皮细胞transwell迁移实验中,实验组(URG4/URGCP肝癌细胞系QGY7703和Hep3B)人类脐静脉内皮细胞的迁移量均大于对照组(空载体肝癌细胞系QGY7703和Hep3B),差异具有统计学意义(P<0.05)。在鸡胚尿囊膜实验中,实验组(URG4/URGCP肝癌细胞系QGY7703和Hep3B)新生成的血管数量均大于对照组(Vector肝癌细胞系QGY7703和Hep3B),差异具有统计学意义(P<0.05)。在实时定量PCR实验中,实验组(URG4/URGCP肝癌细胞系QGY7703和Hep3B)血管内皮生长因子C的mRNA表达量均高于对照组(Vector肝癌细胞系QGY7703和Hep3B),差异具有统计学意义(P<0.05)。在酶联免疫吸附实验中,实验组(URG4/URGCP肝癌细胞系QGY7703和Hep3B)血管内皮生长因子C蛋白表达量均高于对照组(Vector肝癌细胞系QGY7703和Hep3B),差异具有统计学意义(P<0.05)。3、沉默URG4/URGCP抑制HCC细胞的血管增生和VEGFC的表达。在URG4/URGCP蛋白免疫印迹实验中,实验组(URG4/URGCP-Ri肝癌细胞系QGY7703和Hep3B) URG4/URGCP蛋白表达量低于对照组(RNAi-vector肝癌细胞系QGY7703和Hep3B),差异具有统计学意义(P<0.05)。在人类脐静脉内皮细胞血管生成实验中,实验组(URG4/URGCP-Ri肝癌细胞系QGY7703和Hep3B)中人类脐静脉内皮细胞血管生成数量均低于对照组(RNAi-vector肝癌细胞系QGY7703和Hep3B),差异具有统计学意义(P<0.05)。在人类脐静脉内皮细胞transwell迁移实验中,实验组(URG4/URGCP-Ri肝癌细胞系QGY7703和Hep3B)人类脐静脉内皮细胞的迁移量均低于对照组(RNAi-vector肝癌细胞系QGY7703和Hep3B),差异具有统计学意义(P<0.05)。在鸡胚尿囊膜实验中,实验组(URG4/URGCP-Ri肝癌细胞系QGY7703和Hep3B)新生血管的数量低于对照组(RNAi-vector肝癌细胞系QGY7703和Hep3B),差异具有统计学意义(P<0.05)。在实时定量PCR实验中,实验组(URG4/URGCP-Ri肝癌细胞系QGY7703和Hep3B)血管内皮生长因子C mRNA表达量低于对照组(RNAi-vector肝癌细胞系QGY7703和Hep3B),差异具有统计学意义(P<0.05)。在酶联免疫吸附实验中,实验组(敲除URG4/URGCP基因的肝癌细胞系QGY7703和Hep3B)上清液血管内皮生长因子C蛋白表达量低于对照组(RNAi-vector肝癌细胞系QGY7703和Hep3B),差异具有统计学意义(P<0.05)。4、过度表达URG4/URGCP促进NF-κB信号通路的激活。在荧光素酶报告基因实验中,URG4/URGCP过表达时,肝癌细胞系QGY-7703和HEP3B中实验组NF-κB转录活性高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)；URG4/URGCP沉默时,肝癌细胞系QGY-7703和HEP3B中实验组NF-κB转录活性低于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。在蛋白免疫印迹实验中,URG4/URGCP基因表达时,肝细胞系QGY7703和Hep3B中p-IKK和p-IkBa的蛋白表达量实验组高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而两组间IKK和IkBa蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)；URG4/URGCP基因沉默时,肝细胞系QGY7703和Hep3B中p-IKK和p-IkBa的蛋白表达量实验组低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而两组间IKK和IkBa蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。在实时定量PCR分析中,当URG4/URGCP过表达时,实验组NF-κB下游基团TNFα、IL-6、IL-8和MYC在肝癌细胞系QGY-7703和Hep3B中基因表达量高于对照组(空载体)差异均具有统计学意义(P<0.05)；在URG4/URGCP沉默时,实验组NF-κB下游基团TNFα、IL-6、IL-8和MYC在肝癌细胞系QGY-7703和Hep3B中基因表达量低于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)5、抑制NF-κB信号活力会导致URG4/URGCP诱导的血管增生能力丧失。在NF-κB转录活性荧光素酶报告基因分析中：实验组(IκBa突变表达组肝癌细胞系QGY7703或Hep3B) NF-κB荧光素酶活性均低于对照组(空载体),差异具有统计学意义(P<0.05)。在人类脐静脉内皮细胞血管生成实验中,实验组(IκBa突变表达组肝细胞系QGY7703或Hep3B)人类脐静脉内皮细胞血管生成数量均低于对照组(空载体),差异具有统计学意义(P<0.05)。在人类脐静脉内皮细胞transwell迁移实验中,实验组(IKBa突变表达组)人类脐静脉内皮细胞的迁移量均低于对照组(空载体),差异具有统计学意义(P<0.05)。在鸡胚尿囊膜实验中,实验组(IκBa突变表达组)新生成的血管数量均低于对照组(空载体),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论本项研究表明,在肝癌细胞株中,URG4/URGCP上调,并通过激活NF-κB信号通路促进肝癌血管增生。URG4/URGCP可能是肝癌抗血管增生治疗的潜在靶分子,以期发掘出一个有前景的肝癌诊断治疗策略,为后续研发肝癌的基因免疫疗法提供新的诊治分子靶标,进而为将来肝癌的药物研发及临床诊断提供科学依据。