脂肪组织是机体最大的能量储存库,当机体需要能量的时候,储存在脂肪组织的甘油三酯在脂解酶的作用下被分解为游离脂肪酸,释放入血液参与能量代谢。脂解作用出现障碍或病变,会影响机体能量的平衡,进而引发肥胖和胰岛素抵抗等疾病。激素敏感酯酶(Hormone sensitive lipase ,HSL)是第一个被发现和克隆的脂肪细胞内脂质分解酶,曾被认为是脂肪细胞中脂质分解的唯一限速酶。但随着HSL基因敲除鼠的出现,残留的40%基础脂解作用说明存在着另外的脂肪细胞脂解酶参与脂解作用。2004年底甘油三酯水解酶(Triacylglycerol hydrolase,TGH)、脂肪组织甘油三酯脂酶(Adipose Triglyceride Lipase,ATGL)相继被发现,并迅速成为脂代谢研究新的热点。随着研究的深入,TGH在啮齿类脂肪细胞中承担脂解作用以及体外分解脂质能力已有报道,但其在除啮齿类动物之外其他动物脂肪细胞中表达规律、调控方式、代谢途径,尤其与HSL、ATGL之间的分工协作关系研究甚少。本实验围绕TGH在不同物种(猪、大鼠、小鼠)、不同水平(组织水平、细胞水平、分子水平)表达规律及脂解机理开展研究,同时将与HSL、ATGL作为参照,比较分析TGH在基础脂解及刺激脂解中的地位。检测了猪不同品种、不同发育阶段、不同部位脂肪组织中转录水平差异规律;利用离体培养脂肪细胞技术,对猪、大鼠脂肪细胞中TGH表达时序、以及与脂肪细胞分化、脂解相关性进行了探讨;并利用胰岛素、肿瘤坏死因子-α对猪、大鼠脂肪细胞进行不同浓度、不同作用时间处理,分析其与HSL、ATGL在抑脂解和促脂解通路中变化差异;另外在国际合作项目支持下,与加拿大蒙特利尔圣加斯厅医院研究中心遗传系协作,利用基因芯片技术,分析测定了禁食和高脂日粮饲喂下,TGH与HSL、ATGL变化以及在代谢通路中可能与之相关的调控通路及作用机制。主要研究结果如下:1.研究了TGH在猪不同品种、不同生长阶段以及不同沉积部位脂肪组织中表达规律。证明了TGH与其他脂肪分解酶(HSL)具有相同的表达规律,即与个体的肥胖程度具有负相关性;而且随着生长发育,下调的脂解作用与TGH表达量下调具有一定关系;内脏脂肪组织较其他沉积部位的脂肪表达量显著增高的特性。也进一步说明TGH在整个机体能量代谢中的重要作用。2.比较了猪、大鼠原代脂肪细胞分化过程中TGH表达规律。在猪脂肪细胞中,TGH表达峰值早于脂肪细胞分化最高值,这一特征不同于大鼠脂肪细胞表达峰值伴随分化峰值的结果。同时对猪与啮齿类动物(大鼠)原代脂肪细胞在分化过程中存在的形态学差异,从脂解变化、脂肪分解酶、转录因子、脂肪细胞标志基因表达时序性等方面进行了测定和诱因分析,进一步说明两物种间所表现的分化过程差异,是与脂解酶尤其TGH表达的时序已及其承担的重要基础脂解作用有关。这一结果证实了啮齿类动物在脂代谢通路于与猪存在着差异,并且表明其作为模式动物研究脂代谢具有一定的局限性。3.利用胰岛素(抑脂解激素)和TNF-α(促进脂解脂肪因子),比较分析了猪、大鼠原代脂肪细胞不同浓度、不同时间的处理TGH变化规律。结果显示:(1)胰岛素浓度大鼠脂肪细胞更为敏感;达到抑制猪脂肪细胞脂解作用的浓度是100nmol/L,当浓度上超过200nmol/L以上,脂解作用出现浓度依赖性的增强趋势;(2)胰岛素浓度对于TGH表达量的变化也具有物种差异,当胰岛素浓度达到300nmol/L时,表达量被显著下调,浓度进一步增加,表达量随仍然保持较对照降低,但差异不显著;大鼠脂肪细胞TGH在胰岛素为100nmol/L的时候,显著下调,当浓度增加到300nmol/L以上时,TGH表达量明显上调;(3)猪、大鼠脂肪细胞中脂解作用变化随处理时间也表现出显著差异,随着处理时间的延长,猪TGH表达量出现时间依赖性的下降,而大鼠在24小时之前表现表达量下降的趋势,随着时间进一步延长,表达量重新升高。(4)低浓度(10、30ng/ml)TNF-a对TGH表达量具有上调作用,但是随着浓度增大(大于60ng/ml),TGH表达量下调;在处理6小时后,TGH表达量明显上调,但随后出现时间依赖性的下调作用。TGH变化规律显示只对细胞因子长效刺激作用下发生改变。4.利用基因芯片技术,分析了在禁食条件下TGH变化规律及脂解特性。TGH在禁食情况下,表达量增加值高于HSL、ATGL;禁食引起基础脂解能力增加,很可能TGH承担着主要的脂解作用。同时发现脂肪细胞虽然利用β-2肾上腺受体激动剂(CL)刺激,脂解能力增加,但与对照相比差异不明显,进一步证实起禁食条件下主要承担脂解作用的TGH在激素刺激性促脂解作用不承担主要作用。禁食与正常组织方细胞刺激性脂解能力绝对值增加,而相对差异不显著,进一步说明引起主要代谢变化的TGH不承担或者承担较少的刺激性脂解作用。5.利用基因芯片技术,分析了高脂日粮饲喂后TGH变化规律及脂解特性。高脂日粮饲喂引起体重增加,脂肪细胞内已知的脂解酶都表现出下降的趋势。但与HSL、ATGL相比较,TGH下降幅度最大,并且与基础日粮饲喂组相比较差异及显著, TGH表达量降低是高脂日粮引起的脂肪代谢能力降低最主要的诱因之一。同时CL刺激脂解能力下调,说明TGH承担基础脂解,而非刺激性脂解作用。6.利用基因芯片技术,分析了高脂日粮引起的增重敏感型和非敏感型个体中脂肪细胞中TGT表达量差异。比较了脂肪细胞中已知所有脂质分解酶,发现只有TGH mRNA水平具有增重敏感型低于非敏感型(P<0.001)的差异特征。这一结论说明引起脂肪脂质代谢差异,进而影响肥胖易感性最关键的脂肪细胞脂质分解酶为-----TGH。7.对芯片数据进行高通量、多元化基因表达变化分析,利用多个数据库及分析软件,绘制出TGH分子调控机制网络图。