论文部分内容阅读
促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是由下丘脑神经元分泌的一种含有十个氨基酸的肽类激素，经下丘脑-垂体-门脉系统进入垂体前叶，作用于垂体前叶的促性腺激素分泌细胞，刺激卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone，LH)的分泌，从而调节性腺的发育与配子的形成。已有大量证据表明，GnRH及其受体可广泛存在于下丘脑-垂体轴之外，如免疫系统(T、B淋巴细胞)、生殖系统(卵巢、输卵管、前列腺、睾丸及胎盘等处)以及一些恶性肿瘤(乳腺癌、肺癌、胰腺癌及肝癌等)，对这些组织和器官及恶性肿瘤的生长起调控作用。 我们先前的研究表明，在大鼠的消化系统广泛存在有GnRH及其受体，并且其受体的基因序列与垂体的基因序列一致，说明大鼠的消化系统能自身合成GnRH及其受体，同时这些组织或细胞是GnRH作用的靶细胞，如GnRH类似物可明显促进大鼠颌下腺对神经生长因子的分泌。那么，在培养的大鼠胃平滑肌细胞、胃粘膜壁细胞是否存在有GnRH及其受体，其GnRH的基因序列怎样?GnRH对它们的功能影响如何?均未见报道。因此我们 第囚军匡大学谬玄学伍沦文在先前研究的基础上，进行了以下研究：D」首先对大鼠的胃平滑肌细胞进行了分离培养及鉴定，并采用免疫细胞化学、原位杂交技术在培养的平滑肌细胞上原位检测GnRH受体的表达；［2］运用放射免疫分析法检测了GnRH类似物对大鼠胃平滑肌细胞PKC酶活性的影响，然后运用激光共聚焦技术检测了GnRH类似物对胃平滑肌细胞内Ca’”浓度的影响，以探讨胃平滑肌细胞内 GnRH受体介导的信号转导机制：［3］GnRH类似物对培养的胃平滑肌细胞处理后，分别采用＊T比色法、’H－TdR掺入法、检测PCNA法和流式细胞仪技术观察GnRH类似物对平滑肌细胞增殖情况及细胞周期分布的影响：「d对大鼠的胃壁细胞进行了分离培养及鉴定，运用形态学研究的方法检测了GnRH及其受体在培养的胃壁细胞上的分布，并运用RT－PCR、基因克隆测序等技术对壁细胞分泌的GnRH基因序列进行了研究；［5］ 用激光共聚焦技术检测GnRH类似物对培养的大鼠胃壁细胞内Ca’”浓度的影响，同时检测了GnRH类似物对在体大鼠胃酸分泌的作用，进一步了解GnRH对消化系统功能的调节，为先前提出GnRH也是一种胃肠激素的新观点提供更直接的实验依据。主要研究结果如下： 1．运用免疫细胞化学和原位杂交的方法发现，培养的大鼠胃平滑肌细胞含有GnRH受体免疫反应阳性物质，同样含有GnRH受体InRNA杂交信号，二者均位于细胞浆内，胞核为阴性，说明培养的胃平滑肌细胞能表达GnRH受体，是Gs作用的靶细胞。 2．运用放射性同位素的方法检测了GnRH类似物（阿拉瑞林）对大鼠胃平滑肌细胞PKC ＆活性的影响，发现阿拉瑞林可使培养的大鼠胃平滑肌细胞中PKC活性明显升高，3Inin时达高峰，10Inin后作用明显降低，且成剂量依赖性；同时发现在无外CaZ”时，阿拉瑞林也可使PKC活性升高， ．5－ 第回军皿大学傅士学伍论文但不如有外钙存在时高o＜0．05卜因此PKC活性的增高，并不完全依赖细胞外C八 它可以动员胞内＊“的释放激活PKC。 3．阿拉瑞林可使胞内叨”浓度升高，说明＊”参与了GnRH类似物阿拉瑞林对胃平滑肌细胞作用的细胞内分子转导过程，而细胞内＊扩的升高既源于细胞内钙的释放又源于细胞外钙的内流，外钙的内流主要是通过L－type钙通道实现的，内钙的释放不是通过RyRs受体，而是通过IP3受体实现的。 4．细胞的增殖实验表明，随着阿拉瑞林浓度的增大，与未用药的对照组相比，发现其M17’吸光度K值）逐渐降低（＜0刀5）；P CNCNA表达的平均荧光值逐渐减弱o＜0刀5）：大鼠胃平滑肌细胞的’付＊皿参入量依次减少（P＜（、05卜 且药物浓度越大，此三者下降越明显。在细胞周期中，与对照组相比，GI期细胞所占比例明显增加（P＜．05h S期细胞所占比例明显减少，且随药物浓度的增加而逐渐减少o＜0刀5卜说明＊nRH类似物可明显抑制大鼠胃平滑肌细胞的增殖作用，其作用途径可能是通过平滑肌细胞自身GnRH受体的直接介导而实现的。 5．运用细胞培养技术对大鼠的胃粘膜壁细胞进行了分离与培养，然后采用形态学的研究方法，研究了GnRH及其受体在大鼠胃粘膜壁细胞中的表达，发现胃粘膜壁细胞中含有GnRH蛋白和GnRll－mRNA，H者均定位于细胞浆内，并且发现GnRH受体蛋白及其GnRH受体的IuRNA也定位于细胞浆内，这提示大鼠胃粘膜壁细胞可自身合成和分泌GnRH，在胃粘膜壁细胞GDRH可能以自分泌的方式调节壁细胞的功能。 6．我们从培养的大鼠壁细胞中提取总RNA，应用RT－PCR的方法扩增Gngu基因，并对产洲行纯化回收，连接入pUC19 ＆体中扩增，经eR和酶切鉴定后进行序列分析。结果发现胃壁细胞中GnRH的基因序列与下丘脑的完全一致。 ．6．