研究背景及目的异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)是治疗血液系统肿瘤与非血液系统肿瘤和再生障碍性贫血等疾病的主要手段,甚至被认为是治愈某些肿瘤的唯一方法。移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)是allo-HSCT后的主要合并症,也是当前制约allo-HSCT疗效的最主要因素之一。重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, rhG-CSF)动员的外周血干细胞已逐渐成为造血干细胞的一种主要来源,现广泛用于恶性和非恶性血液疾病的allo-HSCT中。与骨髓移植相比,虽然输入10倍以上的成熟T淋巴细胞,但是GVHD特别是急性GVHD的发病率和严重程度并未明显增加。临床和实验数据表明G-CSF通过影响T细胞的免疫调节效应来降低GVHD的发生率,其机理包括：①直接作用于T细胞,如直接调节T细胞上G-CSF受体,诱导1型辅助性T淋巴细胞向2型辅助性T淋巴细胞极化,促进调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)分化等；②通过效应细胞间接作用于T细胞,如诱导耐受性树突状细胞分化以及改变细胞因子的分泌等。然而,上述机制并不能完全解释G-CSF诱导免疫耐受的全部机制。T细胞的增殖和功能活化主要是通过其表面的T细胞受体/CD3复合物(Tcell receptor/CD3complex, TCR/CD3)而启动。TCR是T细胞表面识别抗原和介导免疫应答的分子,包括α、β、γ和δ四种肽链,以由二硫键连接的异二聚体(a/β)或“/γ/δ)形式存在。T细胞根据其表面TCR的不同,分为αβ+T细胞和γδ+T细胞两群。αβ+T细胞占外周血T细胞的90%-95%,主要参与获得性免疫过程,通过主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)限制性识别细胞。根据是否表达CD4或CD8共同受体分子,成熟的αβT细胞细胞可划分为CD4和CD8两个主要亚群。γδ+T细胞被认为是介于获得性与天然免疫之间的特殊免疫细胞类型,仅占外周血CD3+T细胞的1%-10%,大部分γδ+T细胞不表达CD4、CD8分子,具有特异性识别抗原功能而不受MHC限制,在机体抗感染、抗肿瘤和免疫监视等方面发挥重要作用。由于TCR链缺少一个胞内延长区,TCR需通过CD3分子将活化信号传导至细胞内,导致胞质信号机制的活化,进而调节后续的细胞反应。CD3分子包含：CD3γ、δ、ε、ζ和η(ζ和η为同源异构体)多个亚单位,通常以γε和δε异二聚体及ζζ同二聚体的形式存在,其中CD3ζ链对于跨膜信号传递尤为重要。介导GVHD的免疫反应可能是由某一或某些克隆性T细胞增殖所引起。既往研究发现αβ+T细胞是引起GVHD的主要效应细胞；一些GVHD患者外周血T细胞谱系出现倾斜分布,且部分TCRVβ亚家族呈寡克隆分布。近来研究发现γδ+T细胞具有免疫调节功能,也可能参与GVHD的发病机制。然而,关于G-CSF动员是否影响外周血T细胞受体谱系的变化和T细胞信号转导分子的表达,目前尚无相关研究报道。为了探讨G-CSF对T细胞受体谱系和T细胞信号转导分子的影响,本研究分析了正常健康供者G-CSF动员前后外周血T细胞受体谱系以及CD3分子各亚单位基因的表达水平。新近研究发现：具有免疫调节功能的Treg并不局限于CD4+T细胞,CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞以及γδ+T细胞也具有免疫调节功能的亚群。2009年,Kang等率先在正常小鼠体内发现了具有免疫抑制功能的调节性γδT细胞(regulatory γδ T cells, y8Treg),该细胞属于γδ+T细胞,叉头翼螺旋家族转录抑制物p3(forkhead/winged-helix family transcriptional repressor p3, Foxp3)和CD25表达阳性,能抑制自身CD4+T细胞的增殖；同时,他们发现在肿瘤(肺癌、鼻咽癌、肾癌和胃癌)患者体内也存在该群细胞。随后,该研究组进一步发现：与健康人群相比,系统性红斑狼疮患者外周血γδ Treg数量显著减少,且这种数量减少与系统性红斑狼疮的发展相关,因此提出：γδ Treg有可能作为自身免疫性疾病新的治疗靶点。此外,研究发现：人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)经TCRγδ单克隆抗体(单抗)刺激和转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)诱导后可产生具有免疫调节表型和功能的γδ Treg。然而,G-CSF的免疫调节功能是否能够影响γδ Treg,目前尚不清楚。本研究分析了正常健康供者G-CSF动员前后外周血γδ T细胞功能亚群的变化,并初步探讨G-CSF体外诱导生成γδ Treg的可能性。G-CSF动员的外周血干细胞移植降低GVHD发生率的作用机制至今尚未完全阐明,现研究大多是从直接途径和间接途径两条途径来考虑,从TCR和γδ Treg角度来研究,目前尚无相关报道。因此,本研究目的在于明确G-CSF对外周血T细胞受体谱系、T细胞信号转导分子以及γδ T细胞功能亚群的影响,探讨G-CSF体外诱导生成γδ Treg的可能性,以进一步深入揭示G-CSF对T细胞的免疫调节效应,为研究G-CSF动员的外周血干细胞移植降低GVHD发生率的作用机制提供一条新的思路,为进一步降低GVHD、提高移植存活率提供新的免疫治疗策略。方法1.采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)-基因扫描检测20例供者G-CSF动员前后外周血TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ亚家族T细胞分布和克隆性,实时定量RT-PCR检测20例供者动员前后外周血TCRVy Ⅰ-Ⅲ以及CD3γ、δ、ε和ζ基因表达水平,并结合临床资料观察供者外周血TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ亚家族T细胞克隆性的变化情况与受者GVHD发生情况的关系。2.采用流式细胞术检测15例供者G-CSF动员前后外周血γδT细胞功能亚群的表达比例,并结合临床资料观察供者动员后外周血γδT细胞功能亚群表达比例与受者移植后GVHD发生、原发病复发和生存的关系。3.采用实时定量RT-PCR检测15例供者G-CSF动员前后外周血免疫调节相关分子和G-CSFR基因表达水平,液相芯片技术检测15例供者动员前后血浆细胞因子水平。4.将正常人PBMCs放入含TCRγδ单抗、200IU/mL白介素-2(interleukin-2,IL-2)和10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基的培养体系中进行γδT细胞的体外培养,并加入不同的细胞因子进行诱导。根据添加细胞因子的不同分成4组,分别为：①G-CSF组;②TGF-β组；③G-CSF+TGF-β组；④空白对照组(①-③为诱导实验组)。5.采用流式细胞术检测体外培养后3个诱导组和对照组γδT细胞功能亚群表达比例,实时定量RT-PCR检测4组γδT细胞免疫调节相关分子和G-CSFR基因表达水平,羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester, CFSE)试剂盒结合流式细胞术以及细胞计数试剂盒(cellcounting kit-8, CCK-8)两种方法检测4组γδT细胞对自身CD4+T细胞增殖的抑制作用。6.采用RT-PCR-基因扫描检测4组γδT细胞TCRVγ和Vδ亚家族分布和克隆性,实时定量RT-PCR检测4组γδT细胞TCRVγ Ⅰ-Ⅲ基因表达水平。7.采用液相芯片技术检测4组γδT细胞培养上清中细胞因子水平,CCK-8法检测4组γδT细胞的细胞毒活性,实时定量RT-PCR检测4组γδT细胞Perf和Grmb基因表达水平。8.数据统计分析采用SPSS13.0统计软件包进行处理。G-CSF动员前与动员后外周血TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ亚家族表达个数、TCRVγ Ⅰ-Ⅲ以及CD3γ、δ、ε和ζ基因表达量、γδT细胞功能亚群表达比例、免疫调节相关分子和G-CSFR基因表达量以及血浆细胞因子水平的比较采用配对样本t检验。动员前后外周血TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ各亚家族表达频率的比较采用卡方检验或Fisher检验。二分类logistic回归分析用于分析受者GVHD发生情况与供者TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ各亚家族克隆性变化情况的相关性。因动员前后外周血各CD3基因表达水平不满足正态分布,不同CD3基因表达水平间的相关性分析以及供者年龄与G-CSF动员前后各CD3基因表达水平的相关性分析均采用Spearman秩相关分析。体外培养后3个诱导组和对照组γδT细胞功能亚群的表达比例、免疫调节相关分子和G-CSFR、TCRVγ Ⅰ-Ⅲ等基因表达量、培养上清中细胞因子水平以及细胞毒活性等的比较采用单因素方差分析,当各组方差齐时,用LSD法作进一步多重比较；方差不齐时,用Welch法校正,并用DunnettT3法作多重比较。供者动员后外周血γδT细胞亚群表达比例与受者移植后GVHD发生、原发病复发和生存的相关性分析采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.G-CSF动员后外周血TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ亚家族表达频率发生了不同程度地改变。G-CSF动员前后大多数TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ亚家族均表现为多克隆分布。动员前20例供者中的2例分别在不同亚家族呈寡克隆,1例在TCRVα5, Vβ2, Vβ4和Vβ7中呈寡克隆,另一例在Vβ16中呈寡克隆；G-CSF动员后,20例供者中有5例Vβ16呈寡克隆分布。动员前20例供者中的3例在Vδ6呈寡克隆,动员后则有4例供者在不同Ⅵ和Vδ亚家族呈寡克隆,分别为VγⅡ、Vδ1、Vδ3和Vδ6。G-CSF动员后TCRVγⅠ,VyⅡ和VyⅢ基因表达水平较动员前显著下降(t=2.758,t=3.072,t=3.388; P=0.013, P=0.006, P=0.003)。动员前TCRVy亚家族表达模式为VγⅡ>VγⅠ>VγⅢ,动员后变成VγⅠ>VγⅡ>VγⅢ。动员后供者TCRVβ22亚家族克隆性的改变与移植后患者GVHD的低发生率呈正相关(P=0.042,OR=12.500)；动员后供者TCRVδ1克隆性增殖模式保持稳定与移植后患者GVHD的低发生率呈正相关(P=0.015,OR=0.047)。2.G-CSF动员后外周血CD3ζ、CD3y和CD3ε基因表达水平显著低于动员前(t=2.724,t=2.130,t=3.303；P=0.013,P=0.046,P=0.004)。动员前后CD3δ基因表达水平差异无统计学意义(t=1.930,P=0.069)。G-CSF动员前与动员后CD3各基因表达水平模式均为CD3ζ>CD3ε>CD3δ>CD3γ。3.G-CSF动员后外周血Vδ1亚群比例显著高于动员前(t=-3.939,P=0.001),总γδT细胞和Vδ2亚群比例显著低于动员前(t=2.998,t=3.240；P=0.011,P=0.006)。动员后CD25+和CD27+亚群比例也显著高于动员前(t=-3.342,t=-3.077；P=0.006,P=0.015),动员前后两组间Foxp3+亚群比例无统计学差异(t=0.302,P=0.768).G-CSF动员后外周血Foxp3+Vδ1、CD27+Vδ1、CD25+Foxp3+、 CD25+CD27+和CD27+Foxp3+Vδ1亚群比例均显著高于动员前(t=-2.711,t=-4.050,t=-3.027,t=-3.132,t=-3.942;P=0.017,P=0.002,P=0.011,尸=0.014,P=0.003),CD27+Vδ2和CD25+Vδ2亚群比例显著低于动员前(t=3.312,t=3.590；P=0.008,P=0.003)。动员后供者外周血CD25+CD27+Vδ1和CD27+Foxp3+Vδ1亚群表达比例与患者急性GVHD发生率呈负相关(P=0.032,rs=-0.645;P=0.032,rs=-0.645)； CD27+Vδ1、CD25+Vδ1和CD25+CD27+Vδ1亚群表达比例与患者慢性GVHD发生率呈负相关(P0.014,rs=-0.710;P=0.021,rs=-0.589;P=0.014,rs=-0.710)。4.G-CSF动员后外周血TLR8和G-CSFR基因表达水平显著高于动员前(t=-3.596,P=0.003;t=-2.224,P=0.043),GITR和T-bet基因表达水平显著低于动员前(t=3.035,P=0.009;t=2.644,P=0.019),Foxp3、CD25.CTLA-4和GATA-3基因表达水平动员前后无统计学差异(t=0.210,t=0.992,t=1.291,t=2.009；P=0.837,P=0.338,P=0.217,P=0.064).G-CSF动员后血浆中白介素-10(interleukin-10,IL-10)浓度显著高于动员前(t=-2.484,P=0.026),,动员前后两组间白介素-4(interleukin-4,IL-4)、白介素-17(interleukin-17,IL-17)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和TGF-β浓度均无统计学差异(t=1.206,t=0.574,t=0.278, t=0.772;P=0.248,P=0.575,P=0.785,P=0.453)。5.正常人PBMCs在含TCRγδ单抗、200IU/ml IL-2和10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基的培养体系中体外培养,并加入不同的细胞因子进行诱导扩增。培养9天后对照组γδT细胞纯度可达到70%以上,且大多数γδT细胞为Vδ2亚群。在加入G-CSF和/或TGF-β后,总的γδT细胞数减少,主要表现为Vδ2亚群比例降低和Vδ1亚群比例升高。体外培养后3个诱导组和对照组Foxp3+γδT和Foxp3+Vδ1亚群表达比例有统计学差异(F=7.283,F=5.512；P=0.011,P=0.024)。与对照组相比,G-CSF组、TGF-p组和G-CSF+TGF-p组Foxp3+γδ T和Foxp3+V,61亚群表达比例均显著升高(P=0.015,P=0.006,P=0.003；P=0.044,P=0.014,P=0.005), G-CSF组与TGF-β组和G-CSF+TGF-β组Foxp3+yδT和Foxp3+Vδ1亚群表达比例无统计学差异(P=0.557,P=0.253；P=0.495,P=0.190)。而3个诱导组和对照组γδ T细胞Foxp3+Vδ2亚群表达比例差异无统计学意义(F=1.393,P=0.314)。6.体外培养后3个诱导组和对照组γδT细胞CD25+Foxp3+γδT和CD27+Foxp3+γδT亚群表达比例有统计学差异(F=24.092, F=25.779; P<0.001,P<0.001)。与对照组相比,G-CSF组、TGF-β组和G-CSF+TGF-β组CD25+Foxp3+γδT和CD27+foxp3+γδT亚群表达比例均显著升高(P=0.001,P<0.001,P<0.001；P<0.001, P<0.001, P<0.001), G-CSF组与TGF-β组和G-CSF+TGF-β组CD25+Foxp3+γδ T和CD27+Foxp3+γδ T亚群表达比例无统计学差异P=0.102,P=0.122；P=0.377,P=0.552)。这种差异主要体现在Vδ1亚群,3个诱导组和对照组γδT细胞CD25+Foxp3+Vδ1和CD27+Foxp3+Vδ1亚群表达比例有统计学差异(F=37.465, F=167.294; P<0.001, P<0.001),而3个诱导组和对照组γδT细胞CD25+Foxp3+Vδ2和CD27+Foxp3+Vδ2亚群表达比例无统计学差异(F=3.385,F=3.245; P=0.075, P=0.081)。Foxp3+γδ T细胞主要位于CD25+CD27+区域。7.体外培养后3个诱导组和对照组γδT细胞Foxp3、TLR8和G-CSFR基因表达水平均有统计学差异(F=35.184,P<0.001；F=73.769,P<0.001；F=444.383,P<0.001)。对照组γδ T细胞Foxp3、TLR8和G-CSFR基因表达水平均显著低于G-CSF组、TGF-β组和G-CSF+TGF-β组γδ T细胞(P=<0.001,P=0.001,P<0.001；P<0.001, P<0.001, P<0.001; P=0.030, P<0.001, P=0.012)。G-CSF+TGF-β组γδT细胞Foxp3基因表达水平显著高于G-CSF组和TGF-β组(P=0.002,P=0.001),G-CSF组与TGF-β组γδ T细胞Foxp3基因表达水平无统计学差异(P=0.686)。G-CSF组γδT细胞TLR8基因表达水平显著高于TGF-β组和G-CSF+TGF-β组(P<0.001,P<0.001)。而3个诱导组和对照组γδT细胞CD25、CTLA-4、GITR、GATA-3和T-bet基因表达水平差异均无统计学意义(F=5.285,F=0.888,F=0.206,F=0.131, F=0.355; P=0.080, P=0.488, P=0.890, P=0.939, P=0.787)。8.体外培养后3个诱导组和对照组γδT细胞对CD4+T细胞增殖抑制作用有统计学差异(F=2030.991,P<0.001)。对照组γδT细胞对CD4+T细胞增殖抑制作用显著低于G-CSF组、TGF-β组和G-CSF+TGF-β组γδT细胞(P<0.001,P<0.001, P<0.001), G-CSF组与TGF-β组和G-CSF+TGF-β组γδ T细胞对CD4+T细胞增殖抑制作用无统计学差异(P=0.178,P=0.271)。在TGF-β受体抑制剂阻断下,TGF-β组和G-CSF+TGF-β组γδT细胞对CD4+T细胞的增殖抑制效应在一定程度上逆转,而G-CSF组γδT细胞对CD4+T细胞仍有一定的增殖抑制作用。9.TCRγδ单抗刺激γδT细胞不改变TCRVy和Vδ亚家族的分布；加入G-CSF和/或TGF-β诱导后,部分TCRVγ和VΠ亚家族分布可能发生改变。3例正常人分选γδT细胞和对照组γδT细胞TCRVγ和VΠ亚家族均表现为多克隆分布。3个诱导组γδT细胞在大多数TCRVy和Vδ亚家族中也表现为多克隆分布。3例正常人中2例G-CSF组和TGF-β组γδT细胞在Vδ6呈寡克隆分布,1例G-CSF+TGF-β组γδT细胞在Vδ8呈寡克隆趋势分布。3个诱导组和对照组γδT细胞TCRVyⅠ、VγⅡ和VyⅢ基因表达水平均无统计学差异(F=2.000,F=3.130,F=2.056; P=0.193, P=0.087, P=0.268)。3个诱导组和对照组γδT细胞TCRVy Ⅰ-Ⅲ亚家族的表达模式均为VγⅡ>VγⅠ>VγⅢ。10.体外培养后3个诱导组和对照组γδT细胞IFN-γ分泌量有统计学差异(F=5.626,P=0.023)。对照组γδT细胞IFN-γ分泌量显著高于TGF-β组和G-CSF+TGF-β组γΠ T细胞(P=0.007,P=0.012)。3个诱导组和对照组γΠ T细胞IL-10,TGF-β,IL-4和IL-17的分泌量差异均无统计学意义(F=0.515,F=2.252,F=1.333,F=0.304;P=0.683,P=0.159,P=0.330,P=0.822)。11.体外培养后3个诱导组和对照组γδT细胞Perf和Grmb基因表达水平无统计学差异(F=0.017,F=0.147；P=0.997,P=0.929,),且对Molt4和Raji细胞杀伤率也无统计学差异(F=2.913,F=0.346；P=0.101,P=0.793)。结论1.G-CSF动员不仅可能影响外周血TCRVα、Vβ、Vγ和Vδδ亚家族的分布及表达水平,而且可能改变αβ+T细胞和γΠ+T细胞的克隆性增殖模式。G-CSF动员后供者TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ亚家族谱系表达的改变可能影响移植后患者GVHD的发生,其中G-CSF动员后供者TCRVβ22亚家族克隆性的改变、Vδ1克隆性增殖模式保持稳定与患者GVHD的低发生率呈正相关。2.G-CSF动员主要影响TCR信号通路中的CD3ζ、CD3γ和CD3ε基因的表达,而整体的CD3基因表达模式未发生改变。3.G-CSF动员后外周血γδT细胞和Vδ2亚群比例显著降低,Vδ1亚群比例显著升高,包括Foxp3+Vδ1、CD27+Vδ1和CD27+Foxp3+Vδ1亚群比例均显著升高。动员后供者外周血升高的CD27+Vδ61和CD27+Foxp3+Vδ1亚群表达比例与G-CSF动员的外周血干细胞移植患者GVHD的低发生率呈正相关。4.正常人PBMCs在TCRγδ单抗刺激和G-CSF诱导下可产生调节性γδT细胞,该群细胞主要为Vδ1亚群,主要表达Foxp3+CD25+CD27+表型,与单纯抗体刺激的γδ T细胞相比,Foxp3等多种免疫调节相关分子表达显著上调且具有显著的增殖抑制功能。G-CSF诱导的γδTreg在免疫表型、增殖抑制功能和细胞因子分泌等方面与TGF-β诱导的γδTreg相似,但G-CSF和TGF-β可能通过不同途径诱导产生γδTreg。