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随着纳米科技的快速发展,多种纳米材料已广泛应用于人类生活的各个领域。其中量子点(Quantum Dots,QDs)作为一种直径约为2-20nm新型的纳米材料,主要由Ⅲ~Ⅴ族或Ⅱ~Ⅵ族元素组成,有着独特的荧光特性。常见的量子点包括碲化镉量子点(Cadmium Telluride Quantum Dots,CdTe QDs)、硒化镉量子点(Cadmium selenide quantum dot),以及新型的无镉量子点,其中以CdTe QDs最为常见。与传统有机荧光染料相比,CdTe QDs具有荧光强度高、稳定性好等优点,在活体成像、靶向诊断和治疗上有着巨大的应用前景。在表现出巨大应用潜力的同时,其生物安全评价也日益受到重视。体内研究结果表明,CdTe QDs进入生物体后,肝脏是其主要蓄积器官,并且能够引起肝组织损伤。体外研究结果显示,CdTe QDs能够造成人肝癌细胞(HepG2细胞)存活率降低,线粒体损伤,造成氧化应激和细胞凋亡等毒效应。但目前有关CdTe QDs的肝毒性研究比较少,毒性机制尚不完全明确,研究结果之间因量子点种类、细胞种类的差异而存在诸多争议之处,十分有必要进一步系统性的研究。基于此,本研究采用人肝癌细胞系(HepG2细胞)和人正常肝细胞系(L02细胞)为体外细胞模型,研究CdTe QDs对两种肝细胞的毒性作用和毒性机制,初步探讨自噬和内质网应激在CdTe QDs诱导两种肝细胞损伤中的作用,为后续进一步探讨低剂量和染毒早期细胞损伤机制研究提供基础。1.本研究中通过水相合成的CdTe QDs,利用荧光分光光度计、透射电镜和马尔文激光粒度仪测定CdTe QDs的最大激发/发射波长、粒径、水合粒径以及Zeta电位等理化性质。结果表明,合成的CdTe QDs的最大激发波长和最大发射波长分别为300nm和569 nm,粒径为2.49±0.34nm,在完全培养基中水合粒径为31.93±3.92 nm,Zeta电位为-16.62±0.49 mV。水相合成的CdTe QDs分散性较好,符合实验要求。2.采用MTT法、FITC/PI法检测CdTe QDs染毒HepG2和L02细胞24h后细胞存活率和凋亡率,检测染毒24h后细胞上清液中LDH释放量,光镜下观察染毒后肝细胞形态学改变,石墨炉法检测染毒不同时间后细胞内镉元素含量,判断细胞对CdTe QDs的摄入情况。结果表明,CdTe QDs(0-100μM)染毒两种肝细胞24h后,细胞存活率显著降低(P<0.05),凋亡率显著上升(P<0.05),上清液中LDH含量显著升高(P<0.05),两种细胞之间比较发现CdTe QDs对L02细胞毒性作用要大于HepG2细胞。细胞形态学观察染毒后细胞形态异常,细胞间连接被破坏,镜下细胞数量显著减少。镉元素含量测定结果显示,随着染毒时间延长,细胞中镉元素含量逐渐升高,且同一时间下L02细胞中镉元素含量高于HepG2细胞,与L02细胞损伤更为严重的结果一致。3.采用DCFH-DA法应用流式细胞术检测CdTe QDs染毒肝细胞24h后细胞ROS含量,荧光显微镜下观察ROS荧光变化情况。透射电镜下观察25μM CdTe QDs染毒12h后细胞内质网变化,Western Blot检测CdTe QDs染毒6h、12h和24h后内质网应激标志性蛋白GRP78/Bip,以及染毒6h后PERK、ATF6和p-IRE1α的表达水平。MTT法检测ROS清除剂NAC、内质网应激抑制剂4-PBA和Salubrinal预处理后CdTe QDs染毒肝细胞24h细胞存活率变化。结果发现,CdTe QDs染毒HepG2和L02细胞24h导致ROS含量显著升高,引起氧化应激作用,并且在采用ROS清除剂NAC预处理后细胞存活率显著提升,提示CdTe QDs引起的氧化应激作用促进细胞死亡。Western Blot结果显示,CdTe QDs在染毒6h时即可引起HepG2细胞Bip表达水平升高,说明引起了HepG2细胞内质网应激,染毒12h和24h时内质网应激水平下降,而L02细胞则不同,在6h时Bip只有轻微升高,说明只引起低水平的内质网应激效应,12h和24h Bip表达水平显著升高(P<0.05),说明染毒中后期内质网应激水平显著提升。通过4-PBA和Salubrinal等内质网应激抑制剂预处理后,发现内质网应激在HepG2细胞中起到一定保护作用,而L02细胞中则是促进细胞死亡,这种差异也一定程度上解释了CdTe QDs对L02细胞毒性更大的现象。4.透射电镜观察25μM CdTe QDs染毒肝细胞12h后自噬小体的产生情况。mRFPGFP-LC3双标质粒转染肝细胞后染毒CdTe QDs不同时间,激光共聚焦显微镜下观察自噬流情况。Western Blot检测CdTe QDs染毒6h、12h和24h后自噬标志性蛋白LC3表达水平。MTT法检测自噬抑制剂3-MA和Baflomycin A1预处理后CdTe QDs染毒肝细胞24h后细胞存活率变化。结果显示,HepG2和L02细胞均可被CdTe QDs诱导自噬产生,HepG2细胞在染毒早期(6h)即可引起LC3-Ⅱ表达水平显著提高(P<0.05)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著增大(P<0.05),说明在染毒早期即可引起HepG2细胞产生明显的自噬,而随着染毒时间延长(12h和24h)LC3-Ⅱ表达水平有所降低,但是仍然显著高于对照组,说明此时自噬水平有所下降。MTT结果显示3-MA预处理后HepG2细胞存活率显著上升,说明HepG2细胞自噬的产生加剧了CdTe QDs导致的HepG2细胞毒性。Baflomycin A1预处理后抑制了自噬溶酶体的形成使得自噬体蓄积,导致两种肝细胞细胞存活率显著降低(P<0.05)。L02细胞与HepG2细胞情况有所不同,在染毒早期只有中高剂量组出现了较低水平自噬,但随着染毒时间延长,自噬水平显著提升,但是3-MA预处理后L02细胞存活率轻微上调(P>0.05),说明自噬的产生对CdTe QDs导致的L02细胞毒性的影响较小,只轻微加剧了CdTe QDs对L02细胞的毒性。综上所述,CdTe QDs对HepG2和L02细胞均可产生明显的毒性作用,并且对L02细胞毒性要大于HepG2细胞,主要是由于L02对CdTe QDs摄入更多所致。CdTe QDs引起两种肝细胞氧化应激和内质网应激效应,氧化应激的产生导致肝细胞死亡率升高,而内质网应激对HepG2细胞具有一定保护作用,对于L02细胞则是加剧其毒性。CdTe QDs诱导了两种肝细胞自噬的产生,L02细胞自噬水平的显著提高要晚于HepG2细胞,并且自噬的产生加剧了HepG2细胞的毒性作用,对L02细胞的毒性影响较小。