论文部分内容阅读
L-异亮氨酸(L-Isoleucine, Ile)是人体8种必需氨基酸之一,与L-亮氨酸、L-缬氨酸统称为分支链氨基酸,因有特殊的结构和功能,在人体生命代谢中具有重要的地位。本研究采用诱变育种及基因克隆手段对一株黄色短杆菌Bf420进行改造,以望获得能进行工业化生产的L-异亮氨酸高产菌株。主要内容及成果如下：1、应用纸层析法、纸层析—色斑洗脱比色法和高效液相色谱-邻苯二甲醛法(HPLC-OPA)对发酵液中L-异亮氨酸进行了定性、定量分析研究,确立了L-异亮氨酸定性定量测定的方法、条件以及计算方法。采用纸层析法对发酵液进行测定,通过比较不同氨基酸色斑的Rf值,并与标准样比较,可以快速、方便的定性测量L-异亮氨酸。以HPLC-OPA法与纸层析—色斑洗脱比色法定量测定结果对比,HPLC-OPA法测定结果更为准确。但纸层析—色斑洗脱比色法更加切合实际而且较为简单快速的方法。2、以黄色短杆菌Bf420为出发菌株,经紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)复合诱变,并采用α-氨基丁酸(α-AB)作为抗性药物,通过摇瓶初筛和复筛、单菌落纯化以及连续传代测定,最终选育一株带多遗传标记的遗传性状稳定的L-异亮氨酸高产菌BM2610(Met-+α-ABr),在未优化的条件下摇瓶发酵96h,平均可积累L-异亮氨酸7.12g/L,比出发菌株提高了122.5%。经验证,该菌株遗传稳定性良好。3、进一步对BM2610突变株进行分子改造。利用PCR技术从E.coli JM109中扩增出L-异亮氨酸代谢途径中的关键酶——苏氨酸脱水酶的编码基因ilvA,将其与表达载体pET-28a连接,通过电转化方法,将重组质粒pET-28a-ilvA转入黄色短杆菌BM2610中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得了高效表达。对含质粒的菌体胞内粗酶液经SDS-PAGE检测到大小约为4.6KDa的重组融合蛋白,酶活分析表明,苏氨酸脱水酶的活性比对照组提高了36%。