研究背景和目的:Peutz-Jeghers 综合征(Peutz-Jeghers Syndrome,PJS)是一种常染色体显性遗传病。PJS以皮肤粘膜黑斑、胃肠道多发息肉为主要特征,人群发病率为1/200,000。临床突出表现为因胃肠道生长出大量息肉导致肠套叠、肠梗阻、消化道出血。消化道内错构瘤样息肉是PJS的主要特征,组织学特点是包绕和组成腺体的平滑肌层增生,且由于扭转和梗阻,息肉上皮组织被插入到粘膜肌层以下,从而导致“上皮错构”。口周、颊粘膜的色素斑是本病得另外一特征,这种色素斑也可发生在手指、脚趾、肛周或外阴部位。PJS患者家族的癌发病率明显高于普通人群,其中又以消化道癌最多。伴随着年龄增长,消化道息肉有恶变可能。回顾迄今为止的PJS研究,尚无确切干预措施能根治和预防PJS发病及息肉恶变的发生,仅以定期检查、并对息肉进行及时切除为治疗策略。因此,研究PJS息肉发生及恶变的途径和机制对于PJS患者就具有非常重要的意义。PJS胃肠道癌的发病机制一直存在争议。胃肠道中的恶性肿瘤到底由错构瘤、现有的腺瘤、还是正常粘膜(denove)发展而来?尚无确切结论。一些研究发现,PJS发生胃肠道恶性肿瘤的位置并不总是与错构瘤性息肉的位置相一致。但是,自1965年的一例病例“由十二指肠错构瘤进展而来的十二指肠癌”报道开始,国内外均有大量关于PJS患者胃肠道息肉的“错构瘤—腺瘤—癌”病理过程的报道。依据这一理论,学者建议内镜下息肉切除以减少恶性肿瘤的风险。结直肠癌按发病原因,分为遗传性和非遗传性两类。其中由于遗传因素引发的结直肠肿瘤有林奇综合征(Lynch Syndrome,LS)和家族性腺瘤性息肉病性结直肠癌(familial adenomatous polyposis,FAP)及部分散发性结肠癌。国内外研究发现LS、FAP及散发性结直肠癌的发生、发展的分子生物学途径不同,其发生机制主要分为染色体不稳定性及微卫星不稳定性两种。FAP和85%以上的散发性结直肠癌的发生主要由染色体不稳定引起,而在90%的LS和10%的散发性结直肠癌的发生过程中,主要是微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)起决定作用。错配修复基因(mismatch repair,MMR)的缺陷导致肿瘤发生微卫星不稳定。微卫星不稳定性(MSI)的检测方法分为错配修复基因的免疫组化法检测和基因突变法检测两种。通过免疫组化技术检测hMLH1、hMSH2、hPMS2、hMSH6四个基因来确定MSI的方法,已被国内外广泛采用。基因突变检测则通过数个微卫星位点来检测MSI,检测位点的选择基本遵循1997年“微卫星不稳定和复制错误表型在肿瘤检测和肿瘤家族性预测中的应用研究会”中所推荐的微卫星位点,不同的研究者或机构可在此基础上增加其他位点的检测,以提高检测结果的敏感性和特殊性。LS的病因为MMR基因的突变,其中以MLH1、MSH2,MSH6和PMS2报道最多。MMR基因缺陷导致肿瘤正常等位基因错配修复能力丧失,进而造成肿瘤的微卫星不稳定。一个MMR基因突变携带者有很高的患结直肠癌(25-70%)和子宫内膜癌(30-70%)以及其他肿瘤的风险。PJS作为一种癌易感疾病,其癌发生的原因尚未完全清楚。有研究认为是其致病基因LKB1/STK11发生了致癌突变,然而Nicholas在至今为止最大规模的回顾性临床研究中(419位PJS患者)发现,LKB1/STK11的突变与PJS癌变发生率并无相关性,Hamid对于46个PJS家系的患癌机制的研究也证实了此观点。这些研究高度提示还有其他未知因素(信号通路或者基因)参与了 PJS演变的过程。由于MMR基因错配修复功能改变而出现MSI的患者与PJS患者之间有诸多相似表型:肿瘤易感性、遗传性、结直肠癌高发、患癌年龄低、预后相对较好等,而有关PJS中错配修复基因的表达和微卫星不稳定性的研究,文献未见报道。由此我们开展了关于PJS息肉错配修复基因表达及MSI的研究。旨在探讨错配修复基因hMLH1、hPMS2、hMSH2、hMSH6的表达和MSI在PJS息肉发生发展中的作用及其相互关系,为进一步研究PJS提供帮助。方法1、收集36例新鲜PJS息肉组织、20例新鲜结直肠腺瘤组织、20例新鲜结直肠腺癌组织,分别进行RNA提取和蜡块制作,以20新鲜例正常结肠粘膜组织作对照,通过RT-PCR和免疫组化的方法检测hMLH1、hPMS2、hMSH2、hMSH6基因的表达部位及程度。2、收集代表PJ息肉演化进程中不同阶段的组织标本:20例正常大肠粘膜组织,25枚错构瘤性PJ息肉、11枚腺瘤样变PJ息肉及1枚局灶癌变的PJ息肉;通过免疫组化法在PJ石蜡标本中检测错配修复基因hMLH1、hPMS2、hMSH2、hMSH6蛋白的表达部位及程度。3、对25枚错构瘤性PJ息肉、11枚腺瘤样变PJ息肉、1枚局灶癌变的PJ息肉石蜡标本,提取组织DNA,并以对应病人血液为正常组织作对照。在ABI 3730x1型遗传分析仪上对NR21、Bat26、PentaC、NR27、Bat25、PentaD、Amel、NR24、Mono27共九个微卫星位点进行检测。4、统计方法:采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,数据为计量资料,采用多组比较进行单向方差分析(One Way ANOVA)。组间两两比较,采用Mann-Whitney U Test方法。计数资料表达差异采用R×C表资料的χ2检验。如果资料不符合正态分布或是多组等级资料,采用秩和检验方法(Kruskal.Wallis H)。hMLH1、hPMS2、hMSH2、hMSH6四者之间表达水平的相关性分析采用偏相关分析方法。r偏相关系数表示三者中两两之间相关关系的密切程度。以双侧a=0.05作为检验水准,检验标准以P<0.05为有显著性差异或有相关关系。结果1、以正常结直肠粘膜组织做对照,在PJS息肉组织、结直肠腺瘤组织、结直肠腺癌组织中,hMLH1、hPMS2在PJS组的mRNA、蛋白表达显著低于腺癌组和腺瘤组,后两组间无显著差异。hMSH2、hMSH6在三组中的表达无显著差异。2、在错构瘤性PJ息肉,腺瘤样变PJ息肉及局灶癌变的PJ息肉中检测四种错配修复基因的表达显示:hMLH1、hPMS2、hMSH2、hMSH6的表达水平随着PJ息肉恶变的演化进程逐渐减弱;在正常大肠粘膜表达呈强阳性的高频表达,在错构瘤性PJ息肉中表达开始减弱,并随着正常粘膜一错构瘤性PJ息肉一腺瘤样变PJ息肉一大肠癌的演化过程,表达逐渐减弱。癌变的PJ息肉组织表现为hMLH1、hPMS2蛋白表达缺失。3、25枚错构瘤性PJ息肉、11枚腺瘤样变PJ息肉、1枚局灶癌变的PJ息肉石蜡标本以及20例结直肠腺癌组织石蜡标本进行NR21、Bat26、PentaC、NR27、Bat25、PentaD、Amel、NR24、Mono27九个位点的微卫星不稳定性的检测:错构瘤性PJ息肉组中有23例(92%)呈微卫星稳定性(MSS),2例(8%)呈微卫星低度不稳定(MSI-L);腺瘤样变性PJ息肉组中有7例(63.6%)呈微卫星稳定性(MSS),3例(27.3%)呈微卫星低度不稳定(MSI-L),1例(9.1%)呈微卫星高度不稳定(MSI-H);1枚局灶癌变的PJ息肉呈微卫星高度不稳定(MSI-H)。结论:1、PJS息肉组织的hMLH1、hPMS2mRNA及蛋白表达程度明显低于结直肠腺瘤和结直肠腺癌组织,差异具有显著性;而腺癌和腺瘤组织的表达无显著差异。hMSH2、hMSH6的表达在三组中的表达无显著差异。2、hMLH1、hPMS2、hMSH2、hMSH6的表达随PJ息肉恶变的演化进程逐渐降低,提示其与PJ息肉的形成有关,可能早期参与PJ息肉癌变、是息肉不断进展过程中的重要调控因子。3、微卫星不稳定性的程度随PJ息肉恶变的演化进程逐渐升高,其在错构瘤性息肉中92%为微卫星稳定型(MSS),而在腺瘤样变PJ息肉及局灶癌变的PJ息肉中36.4%呈现微卫星不稳定型(MSI),微卫星不稳定性程度随恶变程度增加而增加。4、错配修复基因hMLH1、hPMS2可能与PJS息肉恶性转化有关,微卫星不稳定程度随PJS息肉恶变程度增加而增加,与错配修复基因检测具有一致性。错配修复基因、MSI可能在PJS息肉恶变过程中起到一定的作用。在PJS患者发生的结直肠癌中,可能出现MMR功能改变以及微卫星不稳定。